《Biology》：Dihydrocoumarin Transcriptionally Activates EcIAA9 to Repress Root Growth of Echinochloa crus?galli
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稗草（Echinochloa crus?galli）是全球十大恶性杂草之一，主要依赖化学除草剂进行防治。然而，长期施用除草剂加剧了杂草抗药性，凸显了对环境友好型替代品的需求。二氢香豆素（dihydrocoumarin）作为一种可降解的天然化感物质（allelo
稗草（Echinochloa crus?galli）是全球十大恶性杂草之一，主要依赖化学除草剂进行防治。然而，长期施用除草剂加剧了杂草抗药性，凸显了对环境友好型替代品的需求。二氢香豆素（dihydrocoumarin）作为一种可降解的天然化感物质（allelochemical），表现出类似生长素（auxin）的活性，并以浓度依赖的方式抑制稗草根系生长，在表型上模拟外源吲哚-3-乙酸（IAA）的作用。已有研究表明，二氢香豆素主要通过生长素信号通路抑制杂草生长。本研究鉴定出EcIAA9，该基因响应二氢香豆素处理并编码一种与EcARF7互作的核蛋白。异源水稻（Oryza sativa）试验显示，在25 mg/L二氢香豆素处理下，EcIAA9过表达使主根抑制率从30.81%（野生型，WT）提高至54.44%和52.00%（EcIAA9?OE）。相反，OsIAA9敲除株系始终表现出较过表达株系更温和的根系抑制趋势。这些差异表型共同确立了IAA9在该通路中作为关键正调控因子的地位。值得注意的是，EcIAA9过表达水稻对二氢香豆素和IAA表现出不同的响应，联合处理产生加性抑制效应。OsARF7敲除未能完全消除二氢香豆素触发的抑制，表明ARF7参与该调控模块，尽管ARF同源物之间的功能补偿可能解释了这一现象。总之，EcIAA9–EcARF7调控模块参与了二氢香豆素触发的根系生长抑制。这些发现表明，二氢香豆素在表型上模拟了IAA对稗草的抑制作用，但通过有所不同的机制发挥作用。本研究为化感物质与生长素信号之间的互作提供了新见解。
杂草是农业系统中最具破坏性的生物胁迫之一，严重制约高产优质作物生产，在主要作物中可造成高达34%的潜在产量损失，远超动物害虫（18%）和植物病原菌（16%）所致损失，甚至可导致完全绝收。稗草（Echinochloa crus?galli）被视为稻田中最难防除的杂草之一，在整个生长季侵染并危害水稻，是水稻高效生产的主要生物限制因素。在热带和亚热带地区，该杂草造成的减产可达50%，且随侵染程度和环境因素而变化。自20世纪90年代以来，化学除草剂因其高效和成本效益在很大程度上主导了杂草管理策略，尤其是在抗除草剂转基因作物引入之后。然而，除草剂过度使用加速了杂草抗药性的发展。迄今全球已记录540例涉及杂草物种和作用位点的独特抗性案例，涉及275个物种，包括156种双子叶植物和119种单子叶植物。在这些抗性杂草中，稗草尤须关注，因其已快速进化出对多种除草剂的多重抗性和交互抗性。抗性日益普遍加之对高风险除草剂的限制，凸显了对可持续杂草管理替代方案的迫切需求。因此，开发和实施有效的防控策略，如生物除草剂应用和新除草剂靶标的发现，对于减轻稗草对水稻种植体系的影响至关重要。特别是基于化感作用（allelopathy）的策略，包括利用化感物质作为生物除草剂，已引起越来越多的关注。
化感作用定义为植物间化学介导的干扰，已成为综合杂草管理系统的重要组成部分，尤其在可持续和有机农业中。利用化感作物、植物残体或覆盖物以及含化感物质的生物除草剂可有效抑制杂草并减少对合成除草剂的依赖。然而，田间规模的证据、非靶标风险评估和成本效益分析仍需在声称环境或经济效益之前进行。化感物质已被分类为14个不同的化学类别。在生理层面，它们通过诱导活性氧（ROS）爆发、改变离子通量以及激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和富亮氨酸重复（LRR）受体样激酶信号级联来破坏细胞稳态。这些干扰最终损害膜通透性、水分和离子吸收、光合作用、呼吸作用、植物激素平衡以及细胞分裂和伸长。在分子层面，已知化感物质通过涉及转录因子和次生代谢物生物合成途径的复杂遗传网络调控植物生长。
在前期研究中，研究人员发现Malachium aquaticum的腐解提取物有效抑制稗草种子萌发。进一步提取和鉴定揭示提取物中的主要化感物质为二氢香豆素，其对稗草根系生长的抑制作用强于香豆素（coumarin）——被广泛视为香豆素类代表性化感物质的化合物。二氢香豆素是该类群中的苯并吡喃衍生物，已被证明干扰稗草中的生长素信号转导，该效应与其对根系生长的抑制作用密切相关。
生长素调控植物生长发育，在建立根系最终构型中发挥关键作用。近几十年来，TIR1/AFB?Aux/IAA?ARF转录通路已被广泛表征为主要生长素信号机制。这些模块由特定的Aux/IAA和ARF组合构成，控制根系构型和适应性生长，包括主根伸长、侧根形成和深根穿透。Aux/IAA基因编码初级转录抑制因子，是对生长素最早和最快响应的基因之一。众多已报道的Aux/IAA基因参与调控根系发育和生长。特别是Aux/IAA基因的过表达会破坏根系构型，引起异常向性响应、主根伸长减少和侧根形成缺陷。作为Aux/IAA抑制因子的关键下游靶标，ARF蛋白参与功能多样化以驱动不同根类型的起始。依赖Aux/IAA?ARF的生长素信号协调控制不同根结构的发育，包括侧根和皮层通气组织，尽管时间和调控模式存在差异。重要的是，环境信号能够重塑该生长素信号模块的输出。例如，高温通过增强ARF7/19的转录活性促进根细胞伸长，即使Aux/IAA稳定性增加。水分梯度进一步通过ARF7的SUMO化修饰调控该级联，在水分受限的根区招募IAA3抑制侧根形成。此外，酚类化感物质如香豆素干扰Aux/IAA蛋白周转并扰乱依赖生长素的根系发育。在此背景下，研究人员聚焦于EcIAA9——一个在稗草响应二氢香豆素暴露时转录响应最强的Aux/IAA家族基因。
为探究其潜在作用，研究人员整合外源IAA处理并比较稗草和异源转基因水稻对二氢香豆素和IAA的响应。鉴于二氢香豆素在根系发育上表型模拟生长素效应，研究人员进一步整合外源IAA处理以比较稗草和转基因水稻对二氢香豆素和IAA的生物学响应。研究人员鉴定了与EcIAA9物理互作的ARF蛋白，并系统表征了EcIAA9过表达、OsIAA9敲除和OsARF7敲除株系对二氢香豆素和IAA单一及联合处理的遗传响应。本研究旨在探究EcIAA9–ARF7模块在二氢香豆素诱导的根系生长抑制中的潜在作用，并比较对二氢香豆素和IAA的表型响应；机制差异仍有待确立。这些发现可能有助于阐明二氢香豆素如何表型模拟生长素作用，并为进一步在稗草中进行原生验证提供基础。
研究人员开展的关键技术方法包括：以稗草种群（与前期研究相同）和水稻（Oryza sativa cv. Zhonghua 11）野生型及转基因株系为材料，采用琼脂生物测定法和Hoagland营养液水培法评估二氢香豆素和IAA对生长的影响；通过生物信息学分析（MEGA 11进行多序列比对和邻接法系统发育树构建）分析EcIAA9序列特征；利用亚细胞定位 assay（pCAMBIA1300?EGFP载体在本氏烟草叶片中瞬时表达）确定蛋白定位；采用qRT?PCR检测基因表达；构建EcIAA9过表达载体和CRISPR/Cas9介导的OsIAA9、OsARF7敲除株系（OsARF7?KO T2种子购自Biogle Gene Company）；通过酵母双杂交（Y2H）和荧光素酶（LUC）互补成像 assay验证蛋白互作；采用Colby法分析联合效应；统计分析使用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey多重比较检验和Mann–Whitney U检验。
研究结果如下：
3.1 二氢香豆素和IAA对稗草的影响：二氢香豆素以浓度依赖方式影响稗草幼苗生长，低浓度促进伸长而高浓度抑制根和茎。1 mg/L二氢香豆素使根长从7.74 cm增至9.40 cm（增加21.38%），而5–25 mg/L均显著抑制根系生长，25 mg/L时根长减少86.80%。茎生长表现一致模式，1 mg/L促进茎伸长（增加16.79%），10–25 mg/L引起显著抑制，25 mg/L时最大减少36.43%。IAA也表现典型双相剂量响应：0.05 mg/L促进根伸长（增加10.30%），50 mg/L时根长减少96.90%。根对两种化合物的敏感性均远高于茎，因此后续实验聚焦于根系表型。
3.2 EcIAA9序列分析：转录组分析表明二氢香豆素显著影响稗草生长素信号转导，EcIAA9被鉴定为该通路中差异表达最显著的基因。EcIAA9的CDS为516 bp，编码171个氨基酸的蛋白，分子量18.64 kDa。多序列比对显示不同物种间EcIAA9氨基酸序列存在众多保守区域，对应功能结构域包括EAR类抑制基序和PB1结构域。邻接法系统发育树显示两个主要分支，稗草与Panicum spp.、Setaria italica和Dichanthelium oligosanthes聚为一支（bootstrap支持率66–98%），第二支包含Miscanthus spp.、Zea mays和Sorghum bicolor，Oryza spp.和Phragmites australis形成独立分支。
3.3 二氢香豆素上调稗草中EcIAA9表达：RT?qPCR结果显示EcIAA9表达随二氢香豆素浓度增加而升高但随处理时间降低。处理后4、12和24 h，20 mg/L组表达量（28.00、25.82、12.43）显著高于10 mg/L组（16.61、14.17、7.46）和对照。48 h时两组表达水平相似（7.54、6.32），但均显著高于对照。
3.4 EcIAA9定位于细胞核：亚细胞定位实验显示IAA9?EGFP融合蛋白定位于细胞核，而空载体对照叶片未检测到明显荧光信号。
3.5 二氢香豆素对EcIAA9?OE和OsIAA9?KO水稻根系生长的影响：未处理条件下，EcIAA9?OE#1和#2根长分别为7.32 cm和7.08 cm，显著短于WT（10.12 cm）；OsIAA9?KO#1和#2根长（9.62 cm和9.90 cm）与WT无显著差异。25 mg/L二氢香豆素处理下，WT根长抑制率约30.81%，EcIAA9?OE#1和#2抑制率分别为54.44%和52.00%，显著高于WT；OsIAA9?KO#1和#2抑制率均低于38.38%，与WT无显著差异。这些发现表明IAA9作为正调控因子可能是二氢香豆素诱导根伸长抑制的核心组分。
3.6 与EcIAA9互作蛋白的鉴定和验证：Y2H实验证实EcIAA9与scaffold41.26和scaffold17.633编码的蛋白特异性互作，而不与scaffold149.50或scaffold5.205互作。LUC互补成像实验进一步验证了这些互作，定量分析显示cLUC?EcIAA9 + nLUC?Scaffold41.26和cLUC?EcIAA9 + nLUC?Scaffold17.633组LUC活性分别较阴性对照增加约2.98倍和4.05倍。测序分析揭示scaffold41.26和scaffold17.633共享高度同源基因序列且均编码EcARF7蛋白，证实EcIAA9与EcARF7的物理互作。
3.7 二氢香豆素对OsARF7?KO水稻根系生长的影响：未处理条件下OsARF7?KO根长（8.72 cm）显著短于WT（11.02 cm）。25 mg/L二氢香豆素处理下，WT根长6.08 cm（抑制率44.78%），OsARF7?KO根长4.72 cm（抑制率约45.89%），与WT无显著差异。结果表明二氢香豆素诱导的根系生长抑制可能涉及依赖IAA9的ARF调控，但ARF7可能不是唯一下游因子，其他冗余ARF可能补偿ARF7缺失。
3.8 二氢香豆素和IAA对水稻根系生长的影响：模拟条件下，EcIAA9?OE和OsARF7?KO根长（5.68 cm和5.88 cm）显著短于WT（7.47 cm）和OsIAA9?KO（6.83 cm）。2 mg/L二氢香豆素处理下，WT和EcIAA9?OE抑制率最高（42.19%和40.18%），OsIAA9?KO最低（23.86%），OsARF7?KO居中（28.89%）。外源IAA处理下，WT抑制率最高（39.28%），OsIAA9?KO居中（30.45%），EcIAA9?OE（16.71%）和OsARF7?KO（15.86%）较低且无显著差异。联合处理下所有基因型根系急剧缩短，EcIAA9?OE抑制率最低（52.20%），显著低于WT（63.84%）。Colby法分析显示联合效应在WT和EcIAA9?OE中为加性，在OsIAA9?KO和OsARF7?KO中为协同。这些表型数据表明EcIAA9和OsARF7均参与二氢香豆素和IAA触发的根系生长抑制响应，EcIAA9?OE对二氢香豆素与IAA的相反敏感性表明该株系对两种化合物响应不同。
讨论部分总结：天然化感物质是开发生物除草剂的有前景的环境友好候选物。自20世纪20年代鉴定胡桃醌植物毒性以来，已表征众多来自作物、森林植物和海洋物种的化感化合物。近年来化感作用研究已从鉴定化感物质和评估杂草抑制效果转向阐明植物毒性机制和相应生物合成途径。与前期报道一致，氢化衍生物对稗草根系生长的植物毒性强于香豆素；本研究进一步表明其通过触发EcIAA9转录干扰生长素信号。二氢香豆素是可降解的环境友好型化感物质，可通过香豆素一步氢化合成，其天然来源丰富赋予经济优势，低毒性和生物安全性已被充分记载。然而，文献记载的低毒性和天然丰度本身并不构成田间水平的环境安全性或经济优势。香豆素的代谢组和转录组分析表明其破坏Eleusine indica的三羧酸循环。积累的证据证实香豆素表现类似生长素的生物活性，Lupini揭示香豆素对根系生长的抑制主要与生长素转运关键蛋白PIN2和AUX1的表达改变相关。此外，利用拟南芥突变体的遗传筛选表明香豆素触发的根系生长抑制依赖核心neddylation酶NAE，该酶调控Aux/IAA蛋白降解。稗草幼苗在二氢香豆素和IAA处理下的表型表征揭示典型的浓度依赖双相效应，低浓度促进根伸长而高浓度抑制。这些平行表型响应提出二氢香豆素可能通过扰动与生长素相关的同一调控通路干扰根系发育的可能性。然而，少有研究探讨氢化等结构修饰是否重塑其植物毒性机制。研究结果表明二氢香豆素（其氢化衍生物）对稗草根系生长的植物毒性强于香豆素，且通过触发EcIAA9转录干扰生长素信号。与Aux/IAA家族基因在不同植物物种中的保守功能一致，积累的证据表明IAA9同源物在模式和作物植物根系发育中执行多样化调控作用。在拟南芥中AtIAA9通过调节茉莉酸稳态参与不定根起始；在水稻中OsIAA9在侧根和根尖特异性表达，调控冠根和侧根数量并介导乙烯诱导的根系生长抑制；过表达OsIAA9的转基因拟南芥表现侧根数增加和向重力性响应降低。基于上述结果，研究人员构建了EcIAA9?OE和OsIAA9?KO水稻株系并检测二氢香豆素处理下的根系表型。正常生长条件下，EcIAA9异源过表达显著抑制根伸长，而内源OsIAA9敲除对根系生长无明显影响。二氢香豆素处理后，OsIAA9?KO未表现显著强于WT的抑制但与EcIAA9?OE差异显著，这可能涉及发育阶段、其他发育调控因子或补偿机制。Aux/IAA通过与原转录因子ARF的动态互作调控生长素信号，这是该通路的核心机制。低生长素水平下Aux/IAA蛋白与ARF二聚化并抑制ARF介导的转录激活；高生长素水平下Aux/IAA蛋白通过TIR1/AFB通路经26S蛋白酶体降解，释放ARF活性。鉴于二氢香豆素上调EcIAA9，研究人员推测升高的EcIAA9可能增强ARF抑制从而贡献于根系生长抑制。利用Y2H和LUC互补实验，研究人员证实了EcIAA9与ARF7的物理互作，表明ARF7是EcIAA9在本系统中的潜在伙伴。值得注意的是，OsARF7已被报道正向调控根系发育，使其成为二氢香豆素诱导根系抑制效应的合理下游介导因子。为遗传验证该假设，研究人员检测了二氢香豆素处理下的OsARF7?KO株系，尽管OsARF7?KO的根系生长抑制率与WT相当，但两基因型间未检测到统计学显著差异，表明ARF7不是该调控通路中IAA9的唯一下游执行者。研究人员进一步表征了EcIAA9?OE、OsIAA9?KO和OsARF7?KO株系在模拟、二氢香豆素、IAA和联合处理下的表型。CK条件下EcIAA9?OE和OsARF7?KO相对WT和OsIAA9?KO表现固有短根。二氢香豆素暴露下WT和EcIAA9?OE表现相当的最大抑制，而OsIAA9?KO抑制显著减弱，OsARF7?KO表现中间响应。IAA处理下WT根系生长抑制最强，OsIAA9?KO表现中等敏感性，而EcIAA9?OE和OsARF7?KO受抑制较轻且无法区分。二氢香豆素和IAA联合处理加剧所有基因型的根系生长抑制，EcIAA9?OE抑制率最低且与WT差异显著。值得注意的是，EcIAA9?OE表现相反敏感性：对二氢香豆素敏感但对IAA耐受，表明二氢香豆素在表型上模拟IAA但可能通过不同分子路线发挥作用。IAA触发Aux/IAA降解，而二氢香豆素上调EcIAA9转录，可能增加抑制性EcIAA9蛋白丰度。联合处理下的严重抑制可能源于生长素信号通路过载。总体而言，IAA9可能作为关键调控节点，但ARF7不是唯一下游执行者，其他ARF成员和平行通路可能提供功能补偿。在前期研究中，研究人员证明二氢香豆素在稗草中发挥植物毒性效应，包括诱导氧化损伤、破坏细胞膜完整性、降低细胞活性并最终导致根细胞死亡。转录组分析揭示二氢香豆素扰动植物激素信号转导，EcIAA9显著上调。基于前期转录组线索，本研究进一步解析了EcIAA9?ARF7介导的生长素信号模块。遗传和蛋白互作分析的证据表明EcIAA9?ARF7调控模块构成介导二氢香豆素触发根系生长抑制的关键分支之一，而非其作用的唯一机制。值得注意的是，尽管二氢香豆素在表型水平模拟IAA引起的根系生长抑制，遗传实验支持两种效应物之间的机制分歧，并与ARF家族成员间可能的功能补偿一致，这仍有待检验。研究结果为理解二氢香豆素的植物毒性活性提供了机制框架，阐明了化感物质植物毒性背后的分子复杂性，其整合了氧化损伤和生长素信号扰动。本研究推进了对化感物质作用与生长素信号之间互作的机制理解。虽然二氢香豆素是生物除草剂开发的有前景化感候选物，但其在农业田间条件下的环境安全性和经济可行性需要全面评估，包括非靶标生物风险评估和成本效益分析。本研究的所有遗传验证均在异源水稻中进行，其携带多个IAA9/ARF7同源物和与稗草不同的调控背景。因此EcIAA9–ARF7模块应被解释为异源证据支持的推定调控单元。未来需要通过稗草中EcIAA9的瞬时敲低/过表达进行原生验证以确认其体内作用。
结论部分翻译：本研究从M. aquaticum中分离了化感物质二氢香豆素，并证实其对恶性杂草稗草的植物毒性。二氢香豆素以浓度依赖方式抑制根系生长，表现出与外源IAA处理诱导相似的表型。研究人员进一步表征了EcIAA9——一个被二氢香豆素强烈诱导的Aux/IAA家族基因。EcIAA9定位于细胞核并与EcARF7样蛋白物理互作。异源水稻系统中的遗传实验表明EcIAA9贡献于二氢香豆素触发的根系生长抑制，作为依赖生长素信号调控中的重要分支而非唯一功能通路。总之，这些发现为二氢香豆素的植物毒性机制提供了新的分子见解，并确立EcIAA9–EcARF7模块作为化感物质作用与生长素信号之间互作的关键分支。
