《Epigenomes》：Trans-Acting Factors in circRNA Biogenesis—Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Receptive and Cancerous Endometrium
环状RNA（circRNA）表达的失调被认为是机体多种过程的主要分子调控机制之一，其中包括子宫内膜癌变（endometrial cancerogenesis）与子宫内膜容受性（endometrial receptivity）的建立。癌变性与容受性子宫内膜被描述为对立面——前者以剧烈增殖和最低分化为特征，而后者则被视为分化程度最高的状态。环状RNA是一类非编码RNA分子，呈闭合环状结构，不具有5′ cap和3′ poly(A) tail，这使其无法被大多数核酸酶识别，并赋予其比线性同源RNA更长的半衰期，同时影响微小RNA（miRNA）和基因的表达。环状RNA的生物发生（biogenesis）受顺式作用元件（cis-molecules）和反式作用因子（trans-acting factors, TAFs）的调控。研究人员重点关注TAFs——作为环状RNA生物发生中的关键分子开关，其在子宫内膜相关研究中的文献记载较少，能够改变环状与线性RNA产物之间的偏向性，进而影响细胞结构与功能。目前，超过2600种TAFs参与广泛的转录程序紊乱。TAFs参与细胞增殖、分化、上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和血管生成。它们在发育和致癌通路中发挥关键作用，同时影响癌症的发生发展以及子宫内膜容受性的建立。对TAFs进行深入详尽的分析有助于促进EC（endometrial cancer）和ER（endometrial receptivity）的诊断与治疗，为反复种植失败（repeated implantation failure, RIF）病例提供解决方案。未来有必要拓展对TAFs作为EC和ER中circRNA调节子应用能力的认知，并研究其作为生物标志物和治疗分子的潜力。
1. Introduction
线性RNA具有5′帽子和3′尾巴，而环状RNA（circular RNA）的5′和3′末端通过共价键连接形成闭合环，缺乏5′至3′极性和poly腺苷化尾，使其无法被过去的poly腺苷化转录组分析识别。环状RNA的生成存在两种反向剪接模式：直接反向剪接和套索驱动环化，两者均需剪接体机器参与，并受顺式调控元件和反式作用因子影响。其中顺式调控元件主要为剪接点附近的内含子互补序列，而反式作用因子大多由RNA结合蛋白构成。剪接过程及成熟因子的改变可导致环状RNA生物发生异常。目前已知大量环状RNA具有细胞和组织特异性，在健康和疾病中均存在差异表达，部分表达高于其线性同源物，并通过表观遗传调控在转录和转录后水平发挥基因表达调控作用。近期证据表明不同癌症中环状RNA表达发生改变。然而，关于子宫内膜中反式作用因子异常对环状RNA生物发生影响的文献仍然稀缺。本研究旨在概述子宫内膜癌和容受性子宫内膜中环状RNA表达改变的潜在反式作用因子，这两种子宫内膜在增殖与分化过程中被视为对立面。
2. Biogenesis of circRNAs and Mode of Action of circRNAs
尽管环状RNA比线性同源分子更稳定，且其形成由经典剪接体机器催化，但组装效率不高，需顺式调控元件和反式因子协助将结合位点拉近。环状RNA加工依赖侧翼内含子互补序列配对，可由重复元件如Alu元件或非重复但互补的30-40个核苷酸（nucleotides, nt）短序列介导，更长序列配对可增强形成能力。结合pre-mRNA末端的蛋白质（反式因子）也能协助侧翼内含子靠近。肌肉盲蛋白1（Muscleblind, MBNL1）作为促进因子通过桥接内含子上调环状RNA表达；作用于RNA的腺苷脱氨酶1（Adenosine Deaminase 1 acting on RNA, ADAR1）作为抑制因子，影响双链RNA（dsRNA）中的腺苷-肌苷（A-to-I）转化，导致配对减少和反向剪接降低，敲低ADAR1可上调环状RNA。反向剪接与经典剪接竞争同一剪接体机器，多种因素在全基因组水平影响这一竞争，导致环状与线性RNA表达谱动态改变。大多数环状RNA由外显子及侧翼内含子构成，仅由外显子形成的称为外显子环状RNA（ecircRNA），外显子和内含子共同构成的称为外显子-内含子环状RNA（EIcircRNA），仅由内含子构成的称为内含子环状RNA（ciRNA）。CiRNA由pre-mRNA剪接中遗漏的内含子形成，通常含有靠近5
′端的7nt GU富集元件和靠近分支点的11nt C富集元件。环状RNA主要通过抑制微小RNA（miRNA）活性发挥功能，作为海绵吸附miRNA从而调控靶基因表达。首个被鉴定的环状RNA CDR1as具有多个miRNA-7结合位点，其中63个在物种间保守，敲除可导致斑马鱼和小鼠miRNA-7下调并引发中脑损伤。基于遗传保守性已建立转基因海绵模型。环状RNA/miRNA/基因网络示例如circITCH通过吸附miR-214和miR-22-3p上调ITCH和CBL基因表达，参与WNT/β-catenin通路。环状RNA还可作为蛋白诱饵，如circFOXO3捕获CDK2/p21和HIF-a/ID1分别阻断细胞周期和诱导细胞衰老。环状RNA虽编码潜能较低，但已发现其具有内部核糖体进入位点（Internal Ribosome Entry Site, IRES），且N6-甲基腺苷修饰（m
6A）可在体外和体内翻译成肽段。环状RNA可直接偶联母本mRNA并调控翻译，这取决于初级序列和三级结构，其翻译能力为诊断、预后和治疗提供新视角。环状RNA被选择性地包装进细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）中，EVs提供的脂质双分子层保护赋予其在体液中更强稳定性。包装于EVs中的环状RNA可运输至邻近或远端细胞并影响基因表达或功能。
3. Cis-Acting Regulatory Elements
具有顺式作用的RNA调控基序主要是RNA序列，可存在于二级结构如AU丰富元件或IRES中，可与其他RNA、DNA或RNA结合蛋白共同影响环状RNA形成。它们可位于pre-mRNA的内含子及成熟mRNA的非翻译区（Untranslated Regions, UTRs），影响加工、稳定性、翻译、转运和降解。顺式与反式作用元件持续协作，共同定义基因表达的额外调控层面，其相互作用结果取决于结构稳固性。顺式调控RNA序列的变异在癌症及其他疾病研究中备受关注。
4. Trans-Acting Regulatory Factors
多种反式作用蛋白参与环状RNA生物发生，并在转录后水平改变其表达，影响miRNA水平及细胞增殖、分化和迁移。反式作用因子可分为四类：剪接体因子、切割因子、RNA解旋酶和RNA结合蛋白。
4.1. Spliceosome Factors
剪接体由五种与蛋白质复合形成的小核仁RNA（small nuclear RNAs, snRNAs）构成小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoproteins, snRNPs），参与反应的snRNAs包括U1、U2、U4、U5和U6。pre-mRNA外显子及侧翼内含子具有snRNP结合位点，通过相互作用调控环状RNA合成。U2辅助因子（U2 auxiliary factor, U2AF）参与U2 snRNP与分支点结合，已在黑色素瘤、乳腺癌、胶质瘤和结肠腺癌中被鉴定为致癌基因。U2AF2改变线性与环状RNA偏向性，由于反向剪接需要更多能量，RNA结合蛋白的结合可促进环状RNA形成。在结肠腺癌中，U2AF2影响肿瘤免疫微环境，调节CD4+ T细胞功能；体外U2AF2敲低显示癌细胞增殖、迁移和凋亡改变。U2AF2在结肠腺癌中上调且预后不良；在胶质瘤中，U2AF2与环状RNA ARF1（cARF1）均高表达且与生存不良相关。
4.2. Cleavage Factors
切割因子直接剪接形成环状RNA所需的外显子侧翼内含子。例如ESRP1靶向环状RNA的GGT富集序列，加速circANKS1B和circUHRF1生物发生；在乳腺癌中，ESRP1上调与circANKS1B上调一致，且与临床分期和生存率相关，ESRP1高表达患者预后不良。circUHRF1高表达促进肿瘤增殖、迁移、侵袭和EMT，与口腔鳞状细胞癌预后不良相关。NUDT21是CFIm（Cleavage Factor Im）复合物组分，作为二聚体连接两个UGUA序列并形成环，阻止CPSF（Cleavage and Polyadenylation Specific Factor family）介导的pre-mRNA剪接，促进环状RNA形成。在肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）中，多数circRNA下调，NUDT21下调抑制含UGUA的circRNA产生，导致细胞增殖失衡，NUDT21低表达患者总生存期不良。pre-mRNA 3′端加工复合物参与环状RNA环化。CPSF4是30 kDa锌指蛋白，特异性结合pre-mRNA上的PAS调控元件，抑制环状RNA形成。HCC中CPSF4高表达与circRNA下调及细胞增殖诱导相关，且高表达与患者预后不良相关。其敲低与前列腺癌细胞系G1和G2期阻滞相关，免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）检测证实其在前列腺癌组织中表达。
4.3. RNA Helicases
RNA解旋酶参与剪接和翻译中RNA的解旋，靶向破坏互补重复序列形成的dsRNA结构，通过破坏反向Alu茎环消除剪接位点空间邻近性，作为环状RNA生物发生的负向调节因子。DExH-box解旋酶9（DExH-box helicase 9, DHX9）是核RNA解旋酶，接触反向互补序列从而解绕环化外显子侧翼的RNA配对，阻断环状RNA生物发生。在肺腺癌（Lung Adenocarcinoma, LUAD）中，DHX9与AluJo/AluSc结合位点连接并下调circDCUN1D4，导致后者下调。DHX9还负向调控circPICALM，后者在膀胱癌中下调且与总生存率下降相关。DHX9通过附着于内含子14和16中的反向互补序列（I14RC和I16RC）转录后调控肿瘤抑制因子cSMARCA5的生物发生；在HCC中，DHX9上调并与cSMARCA5下调相关。在三阴性乳腺癌（Triple-Negative Breast Cancer, TNBC）中，circSEPT9显著上调并与不良预后相关。外显子-连接复合体（Exon Junction Complex, EJC）组分EIF4A3通过结合circSEPT9 pre-mRNA侧翼区域，促进反向剪接并上调其合成。
4.4. RNA-Binding Proteins
RNA结合蛋白（RNA-Binding Proteins, RBPs）使受体位点与供体位点靠近，与外显子侧翼内含子相互作用，增加环状RNA合成。例如异质核核糖核蛋白L（Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein L, HNRNPL）、QKI和FUS。HNRNPL与circLMO7侧翼内含子结合，促进其上调合成；TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库显示HNRNPL在胃癌中上调且与circLMO7表达正相关。QKI二聚体与单一RNA上两个独立RNA识别元件结合，缩短环化外显子距离。在HCC中，QKI上调导致circZKSCAN上调；QKI异常下调导致circZKSCAN1下调并加速癌细胞生长。FUS是原癌基因，在结直肠癌中表达上调且与CircLONP2表达上调及患者低总生存相关。研究已鉴定出circ-LONP2作为microprocessor复合物的circRNA组分。FUS结合于ZNF609 pre-mRNA上游，促进肺癌中CircZNF609生物发生。
5. Mode of Action of TAFs
反式作用因子通过促进或抑制pre-mRNA反向剪接来调控环状RNA生物发生。
5.1. Promoters of CircRNA Biogenesis
MBL、QKI和FUS作为环化促进因子，特异性结合侧翼内含子位点，将上游和下游剪接位点靠近。MBL参与circMBL形成，QKI在EMT中具有活性。FUS结合侧翼内含子选择性剪接位点，促进circRNA_0000285合成，与妇科恶性肿瘤相关，上调恶性细胞增殖和迁移。SF3B1生理状态下主要偏好线性剪接，识别经典分支点序列并招募U2 snRNP组装剪接体，使偏向性转向线性剪接；而突变体K700E可替代分支点并促进某些致癌转录本的环化。
5.2. Inhibitors of CircRNA Biogenesis
ADAR1作为双链RNA编辑酶，解绕内含子互补序列（Alu反向重复序列）并发挥A-to-I编辑作用，抑制环状RNA形成。RNA解旋酶如DHX9通过解绕内含子二级结构或互补碱基配对（Alu元件）消除剪接位点紧密邻近性，减少过度环化。
6. Trans-Acting Regulatory Factors in Endometrial Cancer
子宫内膜癌是常见妇科恶性肿瘤，起源于子宫内膜腺上皮，分为1型（雌激素应答型，占80-85%）和2型（雌激素非依赖型，占10-20%，高级别且侵袭性更强）。尽管诊断和治疗方案不断进步，全球发病率和死亡率仍持续上升。TCGA将子宫内膜癌分为POLE超突变型、微卫星不稳定性高（Microsatellite Instability-High, MSI-H）、拷贝数低（Copy-Number Low, CNL）和拷贝数高（Copy-Number High, CNH）四种亚型。靶向免疫治疗对晚期或复发性MSI-H/dMMR型有效。RNA剪接调控基因表达转录后水平，剪接因子（Splicing Factors, SFs）在癌症中异常调控导致剪接错误。连接长内含子剪接位点的重要SF是RNA结合蛋白FUBP1，它结合顺式作用元件，稳定U2AF2和SF126于3'ss。SF3B1过度表达导致多个基因错误剪接。NUDT21结合poly(A)上游UGUA区域，形成环结构，阻止线性RNA形成并促进反向剪接形成环状RNA。NUDT18作为Nudix水解酶家族成员，在子宫内膜癌中较正常组织上调，发挥肿瘤抑制作用，其上调与肿瘤进展负相关，被认为是有利预后标志物。免疫组织化学和GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）显示NUDT18在早期子宫内膜癌中上调并随分期增加逐渐下调，与分期、组织学分级和肌层浸润显著相关，高表达组织中免疫细胞丰度增加，差异下调通路包括细胞周期、TGF-β信号通路、RNA降解、黏附连接、基础转录因子和DNA复制。RNA解旋酶促进环状RNA生物发生，这些环状RNA作为致癌miRNA海绵，通过调控PI3K和MAPK通路影响肿瘤进展和化疗耐药。DHX9作为环化抑制因子，解绕具有反向重复序列（Alu元件）位点的dsRNA并阻止内含子配对；研究显示选择性DHX9抑制剂（DHX9i）可抑制高级别浆液性卵巢癌和子宫内膜癌细胞增殖，诱导DNA损伤、染色体不稳定和有丝分裂失败。QKI作为RNA结合蛋白，调节可变剪接并稳定环状RNA；子宫内膜癌组织中QKI高表达与某些环状RNA（如PUM1）上调相关，导致相关miRNA下调，从而加速增殖和侵袭。
7. Trans-Factors and Endometrial Receptivity
子宫内膜在月经周期分泌期对胚胎植入具有容受性，这一时期称为种植窗（Window of Implantation, WOI）。容受性子宫内膜具有最高分化程度，而癌变子宫内膜以高水平增殖和最低分化为特征。在容受性子宫内膜中，某些环状RNA通过改变miRNA表达对容受性建立发挥关键作用。剪接体组分如U1和U2 snRNP耗竭可使剪接体从经典剪接转向反向剪接。RNA结合蛋白如FUS、MBNL1和QKI与剪接体协同作用，将外显子靠近形成共价连接。通过吸附抑制植入促进基因（如HOXA10、LIFR和FOXO1）的某些miRNA，激活改善子宫内壁容受性的通路。切割因子：CPAs与内含子序列相互作用形成环并产生环状RNA，NUDT21促进环状RNA形成，CPSFs可促进或抑制环化。RNA解旋酶如DHX9、DDX5解绕内含子RNA以帮助或抑制环化。这些环状RNA表达改变通过吸附相关miRNA，激活HOXA10、PTGS2、LIF和VEGF等基因，这些基因参与调控子宫内膜蜕膜化的多个通路，促进胚胎着床。QKI在环状RNA形成中发挥剪接作用，其适当水平对细胞分化至关重要，被认为是子宫内膜细胞增殖与分化平衡的关键开关。
8. Trans-Acting Proteins—Potential Therapeutic Targets for EC and ER
作为调控分子，反式作用蛋白是EC和ER的潜在治疗靶点，影响环状RNA生物合成和表达。反式作用因子/环状RNA/miRNA调控网络可改变特定基因表达，激活特定通路，影响子宫内膜上皮细胞增殖、分化、成熟和进程。这些新型治疗策略面临挑战：药物需具备核通透性和稳定性，因为反式作用因子在细胞核内发挥作用；反式作用因子与环状RNA结合界面高度保守，选择性难以实现，增加随机毒性抑制风险。直接调控包括基于肽的抑制，工程化肽模拟相互作用表面以阻止结合。还可揭示新型变构结合位点。靶向蛋白降解：PROTACs（Proteolysis Targeting Chimeras）是双功能分子，同时结合反式作用因子和E3泛素连接酶，标记调控蛋白使其被蛋白酶体降解。间接破坏策略则针对反式作用因子与其必需辅助因子的相互作用。
9. Conclusions
环状RNA表达的改变是驱动健康和病理改变子宫内膜诸多过程的主要分子机制之一。反式作用因子作为关键分子开关，调控环状RNA表达，形成下一级调控水平。已有UV交联、质谱、RNA interactome capture、交联免疫沉淀、免疫组织化学染色和计算预测等方法可用于其识别。尽管其生物学功能已知，但在健康和病变子宫内膜中的确切作用机制仍 largely unknown。由于子宫内膜癌的复杂特征，需要深入调查反式作用因子作用。目前关于癌变和容受性子宫内膜中调控环状RNA生物发生的反式作用因子信息稀缺，这使其成为未来研究方向，因这些因子有潜力成为EC诊断和RIF解决方案的新生物标志物和治疗靶点。有必要进一步研究以拓展反式作用因子的临床应用潜力。
