《Vaccines》：Intratracheal Delivery of a CTB-Fused MPN162 Subunit Vaccine Enhances Antibody Responses and Protects Mice Against Mycoplasma pneumoniae
编辑推荐：
背景：肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）是儿童和青少年呼吸道感染的主要病因。大环内酯类耐药性不断增加且尚无市售疫苗，凸显了有效预防策略的必要性。研究人员的初步抗原筛选工作鉴定出MPN162为潜在疫苗抗原，但其单独免疫原性有限。本研究评估了
背景：肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）是儿童和青少年呼吸道感染的主要病因。大环内酯类耐药性不断增加且尚无市售疫苗，凸显了有效预防策略的必要性。研究人员的初步抗原筛选工作鉴定出MPN162为潜在疫苗抗原，但其单独免疫原性有限。本研究评估了与霍乱毒素B亚单位（cholera toxin B subunit, CTB）融合及气管内递送能否改善MPN162诱导的保护作用。方法：在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达重组CTB-MPN162融合蛋白，命名为CTB-162。BALB/c小鼠经气管内或皮下途径免疫MPN162或CTB-162。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗原特异性血清IgG和IgA应答。肺炎支原体攻击后，采用数字PCR（dPCR）定量肺部细菌DNA负荷，并检测肺部炎性细胞因子。通过体重、血清生化和炎症标志物及组织病理学评估单次高剂量CTB-162的短期安全性。结果：气管内给药诱导的抗MPN162 IgG和IgA应答显著高于皮下注射，且攻击后肺部细菌DNA负荷更低。CTB-162诱导的IgG应答强于单独MPN162，5 μg剂量组在受试组中诱导最高的IgA应答。攻击后，5 μg CTB-162剂量组肺部肺炎支原体DNA负荷较PBS组降低超过三个数量级，并显著降低肺部白细胞介素（IL）-6、IL-1β和肿瘤坏死因子（TNF）-α水平。1 μg剂量亦提供显著保护。单次15 μg剂量未引起可检测的短期全身毒性。结论：CTB融合与气管内递送增强了MPN162在小鼠中的免疫原性和保护效力。因此，CTB-162是值得进一步临床前开发的颇具前景的黏膜亚单位疫苗候选物。
肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）是社区获得性呼吸道感染的主要病原，尤其多见于儿童和青少年，感染常表现为咽炎、气管支气管炎或肺炎，重症可伴神经、心血管或皮肤等肺外并发症。由于大环内酯类耐药菌株全球流行，部分亚洲国家临床分离株耐药比例已超过90%，且抗菌治疗无法阻断传播或完全控制周期性暴发，临床管理日益困难，而目前尚无获批上市的肺炎支原体疫苗，因此迫切需要有效的预防性疫苗。肺炎支原体致病涉及细菌黏附呼吸道上皮、毒素介导损伤及宿主过度炎症反应，既往蛋白疫苗研究多聚焦于P1黏附素（尤其是含免疫优势表位的P1C C端区域）等黏附相关蛋白，但尚无P1C为基础疫苗进入临床应用，提示可能需要针对其他致病环节的抗原以拓宽保护潜力。研究人员的初步合作抗原筛选研究鉴定出由M129株mpn162基因编码的MPN162为候选蛋白抗原，其为三酰化脂蛋白，可能经Toll样受体（TLR）1/2相关信号激活固有免疫，但作为疫苗抗原的免疫原性和保护效力尚未系统评价；MPN162不同于既往以黏附为核心的抗原，可能为广谱蛋白疫苗提供互补靶点。重组蛋白抗原常需合适载体、佐剂或递送策略以达到足够免疫原性；霍乱毒素B亚单位（CTB）是无毒载体蛋白，可结合宿主细胞GM1神经节苷脂，促进抗原摄取和呈递，并可形成五聚体结构使融合抗原多价展示，可能增强B细胞受体交联和抗体产生，但CTB融合能否改善MPN162的免疫原性和保护效力尚不清楚；给药途径亦可能影响抗呼吸道病原体疫苗接种效果，气管内递送可直接暴露抗原于肺部，可能增强与肺炎支原体感染部位相关的免疫应答。为此，研究人员构建了CTB-MPN162融合蛋白CTB-162，评价其表达、纯化和寡聚化组装，并在BALB/c小鼠模型中比较皮下与气管内免疫及不同剂量MPN162和CTB-162诱导的抗体应答和保护效力，攻击后检测肺部细菌负荷和炎性细胞因子水平，同时通过体重、血清生化参数、全身炎性细胞因子和主要器官组织病理学评估高剂量CTB-162的初步安全性，以探究CTB融合联合气管内递送能否增强MPN162的免疫原性和保护效力，为开发抗肺炎支原体黏膜亚单位疫苗提供依据。
研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：以（GGGGS）3柔性连接子将CTB与MPN162编码序列融合，经密码子优化后克隆至pET-28a（+）载体并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达带C端His标签的CTB-162，采用镍亲和层析和尺寸排阻色谱纯化，并以SDS-PAGE、非变性条件分析及Western blot鉴定五聚体组装；用pGEX-4T-1载体制备GST-162作为ELISA包被抗原；采用6–8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠（购自北京SPF Biotechnology Co., Ltd.），经气管内或皮下免疫并以肺炎支原体NCTC 10,119株（1×10
8 CCU）气管内攻击；以ELISA测定血清抗原特异性IgG、IgA、IgG1和IgG2a滴度，以数字PCR（dPCR）靶向P1黏附素基因C端保守序列定量肺部肺炎支原体DNA，以化学发光免疫分析法检测肺部及血清细胞因子，并以自动生化分析仪和H&E染色进行安全性评价。
研究结果如下：3.1 表达、纯化与CTB-162融合蛋白表征：CTB-162理论分子量约47 kDa，经IPTG诱导以可溶形式表达于菌裂解上清；尺寸排阻色谱出现聚集体、五聚体CTB-162和单体CTB-162三个洗脱峰，收集五聚体峰进一步表征；非还原非变性条件下CTB-162迁移约250 kDa，与五个单体组成的五聚体预期分子量一致，煮沸加二硫苏糖醇（DTT）后高分子量条带消失、出现约47 kDa单体条带，证实纯化CTB-162组装为稳定同源五聚体；Western blot显示纯化MPN162和CTB-162均被抗His标签抗体特异性识别，CTB-162还被抗CTB抗体特异性检测而MPN162不能，证实融合蛋白身份和完整性，支持其用于后续免疫和攻击保护研究。3.2 气管内递送具有更优免疫原性和保护效力：以GST-162为包被抗原避免抗His标签抗体干扰；第二次免疫后7天气管内组血清抗MPN162特异性IgG滴度显著高于皮下组，第三次免疫后两免疫组均显著高于PBS对照组且气管内组显著高于皮下组；第三次免疫后两免疫组抗MPN162特异性IgA滴度均显著高于PBS组，但皮下组显著低于气管内组，表明气管内递送比皮下给药更有效诱导IgA应答；攻击后两免疫组体重下降均较PBS组轻，气管内组下降最小；攻击后第4天两免疫组肺部肺炎支原体DNA负荷均显著低于PBS组，且气管内组显著低于皮下组（p<0.0001），表明气管内免疫后肺部肺炎支原体特异性DNA负荷降低更明显；综上气管内递送CTB-162诱导更强的血清抗MPN162特异性IgG和IgA应答并更优控制肺部肺炎支原体负荷，故后续免疫实验均选用气管内途径。3.3 CTB-162增强MPN162免疫原性和保护效力：设PBS、MPN162（5 μg）、CTB-162（1 μg）和CTB-162（5 μg）四组；第二次免疫后7天两个CTB-162组已产生明显抗MPN162特异性IgG应答且显著高于PBS组，表明仅两次免疫即可诱导可测的抗原特异性抗体应答；第三次免疫后所有抗原免疫组IgG滴度进一步升高，1 μg和5 μg CTB-162组IgG滴度均显著高于MPN162组；5 μg CTB-162组抗MPN162特异性IgG1和IgG2a滴度显著高于MPN162组，1 μg CTB-162组虽也较高但差异无统计学意义；两个CTB-162组抗MPN162特异性IgA滴度均显著高于MPN162组，5 μg CTB-162组IgA应答最强，表明CTB融合增强了MPN162诱导抗体应答的强度和广度，尤其抗原特异性IgA应答；攻击后第4天，与PBS组相比5 μg CTB-162组肺部TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著降低，1 μg CTB-162剂量亦减轻肺部炎症且IL-1β降低显著大于MPN162组，其TNF-α和IL-6水平虽低于MPN162组但差异无统计学意义；攻击后三免疫组体重下降均较PBS组轻；数字PCR定量显示MPN162、1 μg和5 μg CTB-162免疫均较PBS对照显著降低肺部肺炎支原体DNA负荷，5 μg CTB-162组降幅最大，较PBS组降低超过三个数量级且显著低于MPN162组，该法不能区分活菌与非活菌DNA，但结果表明在预设第4天终点CTB-162免疫组肺部肺炎支原体特异性DNA负荷更低；1 μg CTB-162组DNA负荷虽低于MPN162组但差异无统计学意义，然而较PBS组显著降低，支持低剂量CTB-162的保护活性；综上CTB融合大幅增强MPN162免疫原性并改善抗肺炎支原体攻击保护，5 μg CTB-162组尤为明显。3.4 高剂量CTB-162初步安全性评价：小鼠单次气管内给予15 μg CTB-162，免疫后前2天出现一过性体重下降，第3天恢复至与PBS组相当水平，观察期内无持续体重下降或其他明显全身毒性征象；免疫后第7天血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）和尿素水平与PBS组无显著差异，未发现肝、肾或全身组织损伤证据；免疫后0.5、1、3、5和7天监测血清TNF-α、IL-6和IL-1β，CTB-162在0.5天诱导部分炎性细胞因子一过性升高，此后迅速下降，自第1天起基本与PBS组相当，无持续或过度全身炎症反应；H&E染色显示心、肝、脾、肺、肾组织结构完整，与PBS组相比未见明显炎性细胞浸润、坏死、出血或结构破坏；综上单次气管内15 μg CTB-162未引起持续体重下降、血清生化异常、持续全身炎症或主要器官组织病理损伤，支持其在测试条件下良好的初步安全性。
讨论部分总结：研究开发了将MPN162融合于CTB并经肺部直接递送的五聚体黏膜亚单位疫苗候选物CTB-162，其在大肠杆菌中以可溶形式表达并组装为稳定同源五聚体，气管内递送在诱导抗MPN162血清IgG和IgA应答及控制攻击后肺部细菌负荷方面优于皮下注射；CTB融合通过至少两种互补机制改善MPN162免疫原性，其一为五聚体CTB支架为MPN162提供重复多价结构环境、可能提高有效抗原价态并促进B细胞受体交联，其二为CTB作为免疫活性载体经GM1神经节苷脂相互作用促进上皮细胞和抗原呈递细胞对抗原的摄取并可能增强黏膜组织抗原呈递；5 μg CTB-162组IgG1应答数值上高于IgG2a，提示可能的Th2相关体液偏向，但未直接评估T细胞细胞因子产生和细胞免疫应答，故IgG亚类数据仅应视为支持性而非决定性证据；研究使用大肠杆菌生产的非脂化重组MPN162以降低天然脂质部分相关风险，MPN162单独应答相对有限可能部分反映缺乏脂质依赖的固有刺激，CTB五聚化和气管内递送可能通过改善抗原摄取和呈递而不引入肺炎支原体来源脂质成分来弥补该局限；给药途径影响疫苗表现，气管内递送经定量雾化装置实现，但局部免疫机制尚待确定，皮下免疫虽有效诱导全身IgG但诱导IgA能力有限，而检测的IgA来自血清，不能直接证明呼吸道分泌型IgA诱导，未来应定量支气管肺泡灌洗液、鼻或气管分泌物及肺组织中的抗原特异性IgA，且气管内滴注与气溶胶或吸入递送在抗原沉积、分布和局部免疫激活方面不同，结果不应直接外推至吸入接种；安全性方面，1960年代灭活疫苗临床试验曾报告疫苗增强性疾病，本研究单次15 μg气管内给药未引起持续体重下降、血清生化异常、持续全身细胞因子升高或主要器官组织病理损伤，重组制剂不含肺炎支原体来源脂质成分理论上可降低该风险，但攻击后未全面评价疫苗增强性疾病，未来应检查肺部病理、肺IL-17A、中性粒细胞浸润等炎症损伤指标；研究局限包括仅用单一菌株和既定攻击模型评估保护、未直接评估呼吸道黏膜抗体应答、攻击后未行肺部光镜和组织病理学评价、气管内滴注与吸入递送不同以及缺乏CTB单独对照和无关CTB融合对照限制机制解析；未来应评估MPN162与P1C等黏附相关抗原联合的多组分制剂，并研究其剂量平衡、安全性、生产可行性和临床转化。研究结论翻译：总之，本研究鉴定CTB-162为颇具前景的抗肺炎支原体融合蛋白疫苗候选物。CTB融合改善了MPN162的免疫原性，而气管内递送增强了抗原特异性抗体应答和肺部保护。5 μg CTB-162制剂总体表现最佳，在攻击后大幅降低肺部细菌负荷和炎性细胞因子水平。重要的是，在测试条件下高剂量气管内给药未产生明显全身毒性或主要器官损伤。这些发现支持将抗原工程与气管内递送联合用于肺炎支原体亚单位疫苗开发。尚需使用多样临床分离株、局部黏膜免疫分析、细胞免疫学和全面肺部安全性评估的进一步研究以确定CTB-162的转化潜力。
