黄果蓬蘽（Rubus hirsutus Thunb.）与红果蓬蘽成熟果实氨基酸代谢差异的多组学解析：转录组与代谢组联合分析揭示谷氨酰胺及支链氨基酸代谢增强与黄果表型的关联

《Horticulturae》：Comparative Transcriptomic and Metabolomic Profiling Reveals Distinct Amino Acid Metabolism in Mature Fruits of Different Rubus hirsutus Thunb. Genotypes

　　

本研究以红果蓬蘽（Rubus hirsutus Thunb.）基因型'R'与黄果蓬蘽（Rubus hirsutus Thunb. f. xanthocarpus (Nakai) M.Kim）'Y'的成熟果实为材料，采用高效液相色谱（HPLC）、代谢组学和转录组学技术，描述两种基因型蓬蘽成熟果实间氨基酸代谢、代谢物积累及基因表达的差异，并分析黄果变型与野生红果之间的代谢特征。结果表明，黄果'Y'的游离氨基酸含量（1638.6 μg/g FW）显著高于红果'R'（1331.8 μg/g FW），其中谷氨酰胺差异最为显著。代谢组学鉴定出232个差异代谢物：红果因花青素富集而呈深红色，黄果则以色酮苷和黄酮醇为主导呈现亮黄色。转录组筛选获得5052个差异表达基因，其中氨基酸相关生物合成途径差异最为显著。具体而言，编码谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）的基因及参与支链氨基酸代谢的基因在'Y'果实中高表达，而与半胱氨酸代谢和芳香族氨基酸代谢相关的基因主要在'R'果实中表达。综上，本研究表征了红果与黄果蓬蘽成熟果实间氨基酸代谢、代谢物及转录本的差异，揭示了氨基酸代谢与果实颜色变异之间的潜在关联，为后续果实颜色与品质调控机制研究提供了理论参考。

研究背景方面，蓬蘽（Rubus hirsutus Thunb.）为蔷薇科野生悬钩子属植物，具有较强的抗病性、旺盛的生长势和高产特性，其果实除鲜食外还可加工为果酱、果汁、果酒等产品，全株及根具有抗炎、解毒、清热、镇静和抗风湿等药用功效。野生蓬蘽果实通常为红色，富含可溶性糖、有机酸、花青素、类黄酮和鞣花酸等生物活性物质，抗氧化能力强。近年来随着消费者对"超级水果"需求增长，蓬蘽因其高抗氧化活性和独特香气受到广泛关注。田间观察发现蓬蘽居群在转色至成熟阶段存在显著果实颜色多态性，除典型红色型外还存在橙黄色变型。果实颜色不仅是商品外观的核心指标，还与营养品质、风味物质及采后抗性密切相关。然而目前蓬蘽研究主要集中于资源调查和部分活性成分的定性分析，不同果色蓬蘽成熟果实间氨基酸组成、关键结构基因及调控网络尚缺乏系统研究。氨基酸代谢在果实品质形成中处于核心地位：氨基酸直接参与蛋白质合成并作为风味前体，支链氨基酸和芳香族氨基酸是多种挥发性香气化合物的前体；其代谢分支与三羧酸（TCA）循环和苯丙烷途径相连，影响抗氧化活性和胁迫响应能力；芳香族氨基酸还是类黄酮和花青素合成的起始原料，直接影响果实呈色。因此研究人员以红果野生型'R'与黄果变型'Y'成熟果实为材料，整合转录组与代谢组分析，旨在表征不同果色基因型间氨基酸及果色相关代谢物的差异轮廓，筛选调控氨基酸生物合成与分解代谢的关键代谢物和候选基因，揭示氨基酸代谢途径与果色性状的潜在关联。

研究人员开展的研究与主要结论：通过对两种基因型成熟果实进行氨基酸定量、代谢组和转录组分析，发现黄果'Y'总游离氨基酸及必需氨基酸含量显著高于红果'R'，谷氨酰胺差异最大（5.21倍）；代谢组鉴定232个差异代谢物，红果富集花青素和黄酮醇/异黄酮类，黄果富集黄酮糖苷类；转录组鉴定5052个差异表达基因，谷氨酰胺合成酶途径和支链氨基酸代谢基因在'Y'中上调，半胱氨酸代谢和芳香族氨基酸代谢基因在'R'中占优势。该研究首次联合转录组-代谢组解析蓬蘽红果野生型与黄果天然变型间代谢分歧，揭示了氨基酸代谢与果实颜色变异的潜在关联，为蓬蘽分子育种提供了候选基因和参考数据，也为其他特色果树色泽与风味品质机制研究提供了多组学整合的方法学参考。

关键技术方法：以南京中山植物园露天基质盆栽的蓬蘽红果野生型'R'与黄果变型'Y'为材料（黄果变型经3个完整独立生长周期营养繁殖表型稳定），每种基因型选9株健康植株分为3组、每组3株，每株采20–30个成熟果实混合为一个生物学重复；采用便携式色差仪测定果面L*、a*、b*色度参数，乙醇浸提-分光光度法测定类胡萝卜素含量；采用高效液相色谱（HPLC）结合邻苯二甲醛（OPA）和9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC）柱前在线衍生化定量游离氨基酸；采用UHPLC-MS/MS非靶向代谢组学结合PCA和OPLS-DA筛选差异代谢物；采用Illumina NovaSeq 6000平台进行转录组测序，Trinity从头组装、edgeR差异表达分析，并以RT-qPCR验证8个氨基酸代谢相关差异基因。

研究结果：（1）两种基因型果实色泽表型特征分析——通过色差仪和类胡萝卜素含量测定发现，红果'R'亮度L值显著低于黄果'Y'而红绿值a显著更高，黄果b值显著高于红果，'R'色度略高而色调角显著低于'Y'，'Y'类胡萝卜素含量（约0.24 mg/g）显著高于'R'（约0.09 mg/g），量化确认了两种基因型鲜明的色泽表型差异。（2）不同基因型果色相关氨基酸及其衍生物测定——通过HPLC定量发现'Y'总游离氨基酸（1638.6 μg/g FW）显著高于'R'（1331.8 μg/g FW），非必需氨基酸为主要组分，'Y'中天冬酰胺最丰富而'R'中脯氨酸最丰富，谷氨酰胺差异最显著（'Y' 97.72 μg/g vs 'R' 18.74 μg/g），'Y'总必需氨基酸含量高于'R'，甜味氨基酸占比最高（41.24–45.42%）。（3）两种基因型果色相关代谢物及衍生物筛选——通过非靶向代谢组学鉴定1045个代谢物，PCA显示正负离子模式分别解释76.49%和76.92%的方差，OPLS-DA筛选获得232个差异代谢物（101个上调、131个下调），其中15个显著差异类黄酮代谢物，8个在'Y'中上调、7个在'R'中下调。（4）两种对比果色基因型间代谢差异分析——通过KEGG富集发现上调代谢物主要富集于代谢途径、辅因子生物合成、丁酸代谢、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢等途径，下调代谢物主要富集于类胡萝卜素生物合成、类固醇生物合成、色氨酸代谢及黄酮和黄酮醇生物合成途径；'R'富集槲皮素、花落素、6″-O-乙酰染料木苷等黄酮醇/异黄酮类化合物，'Y'以羟基红花黄色素A等黄色色素和黄酮醇类上调为主。（5）两种对比果色基因型转录组分析——通过转录组测序鉴定5052个差异表达基因（'Y'相对'R'上调2408个、下调2644个），转录因子以C2H2、FAR1、AP2/ERF、C3H和MYB家族为主；GO富集最显著途径为萜烯合酶活性、质膜和脂质储存；KEGG富集最显著途径为缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸生物合成，差异基因数最多的途径为代谢途径、次生代谢物生物合成、氨基酸生物合成和内质网蛋白加工；氨基酸生物合成途径含39个富集基因（14个上调、25个下调），涉及半胱氨酸、缬氨酸/异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、色氨酸、蛋氨酸和精氨酸生物合成。（6）qPCR验证——随机选取8个氨基酸代谢相关基因进行RT-qPCR，表达模式与转录组结果基本一致，证实转录组数据可靠。

讨论部分总结：果实颜色变异由遗传背景和环境因素共同决定，本研究中'Y'呈亮金黄色表型（高L*、高b*、低a*），'R'呈深红紫色表型（低L*、高a*、低b*），代谢组揭示颜色分歧由多个类黄酮分支的差异积累驱动而非单一色素决定，'R'富集黄酮醇/异黄酮类而'Y'积累黄酮糖苷类，提示两种基因型在前体向花青素生物合成与竞争性糖基化途径间分配不同。酚类化合物方面，'R'总酚丰度约为'Y'的12.7倍，主要由染料木苷、橙皮素-5-O-葡萄糖苷、秦皮苷和花青素矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（kuromanin）驱动，但'Y'中儿茶素、鞣花酸、咖啡酸和对香豆酸等少数酚类更高，表明两种形态差异在于酚类组成而非仅总量；需注意本研究未开展体外或体内生物活性测定，酚类差异的功能意义有待独立实验证实。与已有研究比较，本研究'Y'总游离氨基酸显著高于'R'且谷氨酰胺差异最大（5.21倍），与掌叶覆盆子（Rubus chingii Hu）黄转红过程中必需氨基酸占比达33.62%不同，本研究成熟果实必需氨基酸占比仅10.37%（'Y'）和11.74%（'R'），提示蓬蘽氨基酸分配策略或发育阶段对必需氨基酸积累影响显著。转录组数据提供机制线索：谷氨酰胺合成酶（GS，K01915）在'Y'中高表达与谷氨酰胺积累相关，与黑莓中质体GS丰度成熟期急剧下降而胞质GS稳定的现象不同，'Y'中高GS表达可能反映独特的氮同化策略；支链氨基酸方面乙酰乳酸合酶（K01652）和BCAT（K00826）在'Y'中特异性上调，与缬氨酸和异亮氨酸富集一致，提示黄果可能具有更大的风味前体供应潜力，但需直接挥发性成分谱验证。'R'中半胱氨酸代谢和芳香族氨基酸途径更活跃，尽管丝氨酸乙酰转移酶（K00640）和半胱氨酸合酶（K01738）在'Y'中表达更高，但半胱氨酸和谷胱甘肽在'R'中积累更多，这可能由转录后调控或'R'中谷胱甘肽合成对半胱氨酸需求更高所致，与越橘中"硫代谢-花青素稳定化"机制及'R'中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷丰富积累一致；'R'芳香族氨基酸途径可能为花青素和原花青素生物合成提供苯丙氨酸和酪氨酸前体，将氨基酸代谢直接与红色表型关联。实际应用方面，本多组学发现为蓬蘽种质资源利用提供了宝贵基线信息，红果'R'积累丰富花青素和酚类，黄果'Y'游离氨基酸水平升高；本研究首次采用转录组-代谢组联合分析解析蓬蘽红果野生型与黄果天然变型间代谢分歧，揭示了以往未见报道的不同蓬蘽基因型间氨基酸代谢差异。研究局限在于多组学分析仅揭示基因与代谢物间的相关性，不能证明直接因果调控关系，候选基因功能验证需进一步遗传转化实验。

研究结论翻译：通过整合多组学技术，本研究表征了黄果'Y'与红果'R'蓬蘽成熟果实间氨基酸组成、代谢物积累及关键基因表达谱的差异。主要发现如下：（1）与红果基因型相比，黄果基因型'Y'游离氨基酸和必需氨基酸含量显著更高，以天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺为特征性优势氨基酸组分；值得注意的是，参与谷氨酰胺合成酶途径和支链氨基酸代谢途径的关键基因在黄果中显著上调，该转录模式与'Y'中高效氮同化和风味相关氨基酸积累的代谢特征相关。（2）红果基因型'R'积累高水平脯氨酸和精氨酸，转录组数据表明红果中半胱氨酸代谢、谷胱甘肽代谢和芳香族氨基酸合成途径活性增强，这与花青素苷（如矢车菊素-3-O-葡萄糖苷）的丰富积累及'R'红色果实表型相关。综上，多组学数据揭示了蓬蘽中氨基酸代谢与果实相关性状间的多种潜在联系，氨基酸可能为花青素生物合成等次生代谢提供前体、参与抗氧化防御响应并参与氮运输与利用，但因果调控关系仍待实验验证。这些发现不仅加深了对悬钩子属果实颜色、营养和风味间协同调控网络的理解，也为通过分子育种策略定向改良蓬蘽基因型提供了关键候选基因靶点和理论依据，为优质蓬蘽种质资源的开发利用奠定了基础。