甜菜夜蛾SeABCG转运蛋白在邻甲酰氨基苯甲酰胺类杀虫剂耐受中的功能鉴定与分子机制

《Insects》：Genome-Wide Characterization of ABCG Transporters Involved in Anthranilic Diamide Insecticide Tolerance in Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae)

　　

甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）是全球性重要农业害虫，对多类杀虫剂已出现明显抗性。ATP结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白参与外源毒物代谢，其中G亚家族（ABCG）可介导跨膜外排，但其在甜菜夜蛾中对邻甲酰氨基苯甲酰胺类（anthranilic diamide）杀虫剂的耐受功能此前未见报道。研究人员基于最新基因组与转录组数据，鉴定出17个SeABCG基因，系统解析其发育阶段、组织表达及杀虫剂诱导特征。SeABCG3、SeABCG8与SeABCG10在氰虫苯甲酰胺（cyantraniliprole）和氯虫苯甲酰胺（chlorantraniliprole）处理后显著上调，且在肠、脂肪体、马氏管等解毒组织中高表达。通过RNA干扰（RNAi）敲低上述基因，幼虫死亡率提升20.83%至38.54%；分子对接显示两种杀虫剂均可进入SeABCG3、SeABCG8、SeABCG10结合腔并形成氢键。结果表明，SeABCG亚家族是邻甲酰氨基苯甲酰胺类杀虫剂耐受的关键因子，为基于转运蛋白的害虫治理提供了新靶点。

研究背景与问题提出

甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）是危害棉花、蔬菜与观赏植物的世界性鳞翅目害虫，田间种群已对邻甲酰氨基苯甲酰胺类（anthranilic diamide）杀虫剂产生高水平抗性。代谢抗性依赖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段解毒体系，其中第Ⅲ阶段由ATP结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白（跨膜外排泵）执行外源物主动外排。ABCB与ABCC亚家族功能已有报道，但G亚家族（ABCG，半数转运蛋白，常形成同源/异源二聚体）在甜菜夜蛾中的功能长期空白。研究人员前期证明SeABCB4与SeABCB9参与氯虫苯甲酰胺耐受，本研究进一步追问：ABCG是否同样构成该虫对氰虫苯甲酰胺（cyantraniliprole）与氯虫苯甲酰胺（chlorantraniliprole）的耐受网络。

主要技术方法概览

研究人员以长期室内维持的敏感品系甜菜夜蛾为材料，开展四类关键实验：基于高质量基因组（GCA_011316535.1）的ABCG全基因组鉴定与系统发育分析；发育阶段与组织水平的实时定量PCR（qRT-PCR）表达谱构建；以维拉帕米（verapamil，广谱ABC外排抑制剂）做增效生物测定，并以小干扰RNA（siRNA）注射实施RNA干扰（RNAi）功能验证；基于同源建模与分子对接（Autodock Vina）解析杀虫剂与SeABCG3/8/10的结合模式。

研究结果

3.1 维拉帕米对杀虫剂的增效作用

通过LC₅₀剂量下维拉帕米共喂饲实验，研究人员发现广谱ABC转运蛋白抑制剂可显著提高幼虫对两种二酰胺剂的敏感性，死亡率分别增加17.36%与20.83%，从类别水平提示ABC外排系统参与基础耐受。

3.2 SeABCG系统鉴定与进化特征

基因组挖掘共鉴定17个SeABCG基因，占全部ABC基因31.5%，为最大亚族；蛋白长度270至1270个氨基酸，多含5至8个跨膜螺旋（transmembrane helix, TMH），具保守核苷酸结合域（nucleotide-binding domain, NBD）与跨膜域（transmembrane domain, TMD）架构。系统树显示其与人棉铃虫（Helicoverpa armigera）ABCG亲缘最近。

3.3 时空表达谱

多数SeABCG呈现阶段与组织特异性：SeABCG3、SeABCG8、SeABCG10在幼虫期高表达，并于中肠、脂肪体、马氏管等解毒排泄组织富集；SeABCG8在各阶段与组织均持续高表达，具管家基因样特征。

3.4 杀虫剂诱导响应

以LC₃₀与LC₅₀处理三龄幼虫，SeABCG3、SeABCG8、SeABCG10对两种药剂均显著上调，其中SeABCG6虽亦诱导但在解毒组织表达偏低，故未被优先选入功能验证。

3.5 RNAi敲低增强杀虫活性

针对SeABCG3/8/10设计siRNA注射，敲低效率分别为86.2%、59.8%、45.5%。在LC₃₀药剂胁迫下，敲低后幼虫死亡率对氰虫苯甲酰胺上升27.08%、38.54%、23.96%，对氯虫苯甲酰胺上升22.92%、34.38%、20.83%，直接证明三者贡献于二酰胺类耐受。

3.6 分子对接结合特征

同源建模显示氰虫苯甲酰胺与氯虫苯甲酰胺可嵌入SeABCG3/8/10腔体：SeABCG3靠Thr³⁷⁵、Asn³⁷⁸、Glu⁴⁶⁵形成多氢键，结合能约?8.0 kcal/mol；SeABCG8靠Arg³³、Leu³⁹⁹等残基结合；SeABCG10结合能略低但仍具稳定氢键网络，静态对接支持“结合—外排”假说。

讨论部分总结

研究人员指出，ABCG在甜菜夜蛾中数目与近缘鳞翅目保守，半数转运蛋白特性暗示其需二聚化发挥功能。维拉帕米实验仅提供类级证据，基因结论来自RNAi特异性敲低。SeABCG8组成型高表达，可能兼行稳态转运与屏障功能，不宜单独归因为抗性基因。分子对接能预测结合位点，但未能证明ATP驱动的真实底物转运，后续需荧光底物竞争外排与定点突变验证。结合前期SeABCB研究，甜菜夜蛾第Ⅲ阶段解毒由ABCB（表皮屏障限制穿透）与ABCG（中肠/马氏管主动外排）空间互补完成，并与Ⅰ阶段P450酶协同降毒。

结论翻译

综上，本研究完成甜菜夜蛾ABCG亚家族全基因组刻画，并确证SeABCG3、SeABCG8与SeABCG10为邻甲酰氨基苯甲酰胺类杀虫剂氰虫苯甲酰胺与氯虫苯甲酰胺耐受的关键因子；作为第Ⅲ阶段ABCG半数转运蛋白，其参与甜菜夜蛾解毒网络，可作为转运蛋白导向抗性治理的候选靶标。