《Animals》：Non-Invasive Monitoring of Dense Landes Goose Flocks: An Automated Counting Method Driven by Simulation Data and Robust Trajectory Anchoring
编辑推荐：
尽管利用新鲜稀释精液进行人工授精早已成为家兔繁殖的标准实践，但冷冻保存精液的应用仍面临挑战，主要原因是精液冷冻保存效率较低。影响冷冻保存成功的关键因素之一是适宜精液稀释液的选择。本研究采用经家兔精液改良的同一Lake's稀释液，对两种本地家兔品种——匈牙利巨型
尽管利用新鲜稀释精液进行人工授精早已成为家兔繁殖的标准实践，但冷冻保存精液的应用仍面临挑战，主要原因是精液冷冻保存效率较低。影响冷冻保存成功的关键因素之一是适宜精液稀释液的选择。本研究采用经家兔精液改良的同一Lake's稀释液，对两种本地家兔品种——匈牙利巨型兔（Hungarian Giant）与Chrabrany兔（斯洛伐克地方品种）——的精液冷冻保存效率进行了研究。该稀释液此前在匈牙利巨型兔上已取得最佳冷冻保存效果。两个品种的精液均采用相同的静态冷冻程序。研究人员评估了精子活力（motility）、存活率（viability）、质膜完整性（plasma membrane integrity）、线粒体活性（mitochondrial activity）、顶体状态（acrosomal status）及胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平。结果显示，尽管匈牙利巨型兔新鲜精液质量较高，但冷冻-解冻后Chrabrany兔样本的大多数测定参数更高。该结果表明Chrabrany兔精子对冷冻-解冻的耐受性更好，且改良Lake's稀释液可能也适用于其他家兔品种的精液保存。
研究背景方面，家兔精液冷冻保存研究的历史不如其他家畜物种悠久。虽然新鲜稀释精液人工授精已广泛使用，但精子冷冻保存主要用于实验和基因保护目的。尽管已有若干研究综述了家兔精子冷冻的实践条件，该领域仍存在诸多空白。首先，目前尚无专门为家兔精子冷冻保存开发的精液稀释液。最初使用的Tris基稀释液后来主要被法国商业稀释液（Cortalap、Lepus、INRA 82和INRA 96）取代，近年来 originally developed for stallion semen cryopreservation 的INRAFreeze和BotuCrio等稀释液日益突出。含卵黄的BotuCrio稀释液已在多项家兔精子冷冻研究中成功使用，但研究人员自己的比较研究发现，灭菌卵黄的存在使显微评估困难，尤其在使用计算机辅助精子分析技术时。动物源卵黄还存在卫生劣势和细菌污染风险，且因组成变异大而难以标准化。由于这些缺点，开发和使用无卵黄稀释液的努力日益增加。精液稀释液的基本要求是在精液处理过程中提供充足的营养和保护物质。就冷冻保存而言，应通过尽可能多的机制保护精子免受冷冻和解冻诱导的损伤。由于家兔精子通常需要较低渗透压和pH的稀释液，研究人员此前制备了改良Lake's稀释液。Lake's稀释液最初为家禽公鸡精液稀释而开发，通过减少果糖用量进行改良， resulting in lower osmolality，使其适用于家兔。改良Lake's稀释液补充了甘油（1%）和二甲基甲酰胺（DMF）（4%）作为冷冻保护剂。除有助于维持低渗透压外，甘油比其他一些渗透性冷冻保护剂穿透精子膜更慢，与另一种渗透性冷冻保护剂联合使用时能提供双重保护。两种渗透性CPA（通常为二甲基亚砜DMSO或其他酰胺与甘油）的添加已成为家兔精子冷冻保存的常见做法。联合使用时甘油应谨慎，与DMSO合用时其浓度不应超过1.5%。尽管DMSO-甘油组合最常用，其他组合也已测试。1 M乙酰胺与甘油（0、2或5%）组合未改善精子冷冻后存活率。相反，Domingo等报道使用1%甘油和4%甲酰胺冷冻保存后活力结果可接受。基于这些积极结果，研究人员测试了改良Lake's稀释液中甘油与DMF联合的保护效果，因为单独DMSO在初步研究中未证明足够有效。已发表多项关于各种精子冷冻方案有效性的综述，但其发现难以评估，因为涉及众多变量，包括不同稀释液、CPA、品种和其他方法学因素。在评估不同冷冻保存方法（包括稀释液和冷冻保护剂）后，出现了额外挑战：与其他动物物种类似，家兔品种和品系间精液冷冻性差异很大。斯洛伐克本土家兔品种间新鲜和冷冻/解冻精液的精液质量差异已有报道，与Mocé等的发现一致，即精子参数受基因型和品种影响。若斯洛伐克品种间已观察到差异，则不同国家的本土家兔品种间也可能存在精液质量和冷冻耐受性差异。据研究人员所知，除上述实验外，不同家兔品种精液的冷冻性尚未直接比较。此类研究有必要，因为品种间冷冻耐受性差异已有报道，提示每个品种可能需要个体化冷冻方案。个体和品种相关差异的联合效应支持精子冷冻性变异在一定程度上由遗传决定的观点。基于上述发现，本研究旨在评估改良Lake's稀释液对斯洛伐克本土Chrabrany家兔品种精液冷冻保存的适用性，并比较匈牙利巨型兔（匈牙利唯一本土家兔品种）与Chrabrany兔的精液冷冻性。选择这些品种是因为它们与合作项目内当地家兔遗传资源保护的相关性及生物材料的可获得性。该研究提供了同一冷冻保存方法对两个本土家兔品种适用性的初步评估。
研究人员开展的研究方面，研究在匈牙利国家生物多样性与基因保护中心农场动物基因保护研究所和斯洛伐克国家农业与食品中心动物遗传与繁殖部同时进行。匈牙利巨型兔：10只性成熟公兔，年龄10–22月龄，平均体重6.65 kg（6.12–6.87 kg），单独饲养，12L:12D光周期，环境温度约18–20 °C。动物每日饲喂150–200 g按机构配方制备的特殊家兔繁殖日粮（17.38%粗蛋白、3.04%粗脂肪、16.79%粗纤维、8.78%粗灰分、10.35 AME/MJ代谢能）。干草和添加益生菌与维生素的饮用水自由采食。Chrabrany兔：5只性成熟公兔，年龄2–3岁，平均体重4.83 kg（4.5–5.1 kg）。单独饲养于受控环境条件，环境温度约15–18 °C，12L:12D光周期。自由饮水，饲喂标准商业家兔日粮（最低16.5%粗蛋白、16%粗纤维、3%脂肪、14–16%淀粉、9–11 MJ/kg代谢能）。每周使用预热人工阴道（IMV Technologies, L'Aigle, France）从每只公兔采集精液一次。评估两份射精的精液量和活力，存在凝胶栓时去除。活力使用配备20×物镜的光学显微镜（Leitz Diaplan; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany）主观评估。精子活力按0–5分制评分，基于表现前向运动的精子比例：0，无运动；1，5–20%；2，20–40%；3，40–60%；4，60–80%；5，超过80%。评估家兔精子活力时，必须考虑精液样品中凝胶栓的存在（即使去除后），因其可能妨碍这些类别的精确区分。基于0–5分制主观活力评分，仅质量 adequate（评分4–5）的样品被混合用于冷冻保存。冷冻保存方案：冷冻实验基于混合样品，匈牙利巨型兔10个重复，Chrabrany兔7个重复，因动物间成功采精差异。两个品种使用相同精液冷冻程序。使用此前开发的改良Lake's家兔精子稀释液（0.96 g谷氨酸钠、0.07 g醋酸镁、0.5 g醋酸钾、0.3 g聚乙烯吡咯烷酮、0.4 g D-果糖溶于100 mL蒸馏水；pH：6.95；300 mOsm/kg），补充1%甘油和4% DMF。混合精液样品按1:4比例用含甘油和DMF的改良Lake's稀释液稀释。样品装入0.25-mL细管，最终精子浓度匈牙利巨型兔为23.7–52.4 × 10?精子/mL，Chrabrany兔为25–40 × 10?精子/mL。细管在5 °C平衡60 min。平衡后，细管置于液氮表面上方5 cm处15 min。两个实验室使用相同的20管冷冻装置（Minitube GmbH, Tiefenbach, Germany）。冷冻后，细管在冷冻盒中稳定30 min，然后转移至液氮储罐并保存于液氮中1周后解冻。解冻在40 °C水浴中进行30 s。精液评估：精子活力和浓度——匈牙利实验室使用计算机辅助精子分析系统（CASA, Microptic S.L. SCA?, Barcelona, Spain）评估匈牙利巨型兔精液精子活力。新鲜和冷冻/解冻精液样品用改良Lake's稀释液按1:12（vol/vol）比例稀释。10 μL稀释精液装载于预热显微镜玻片，使用10×物镜检查多个视野直至分析至少500个精子。精子浓度使用Makler计数池（Sefi-Medical Instruments Ltd., Haifa, Israel）测定。斯洛伐克实验室使用SpermVisionTM（MiniTube, Tiefenbach, Germany）在200×放大下评估新鲜和冷冻/解冻Chrabrany精液活力。10 μL按1:10（vol/vol）比例稀释的精液滴置于Makler计数池（Sefi-Medical Instruments Ltd., Haifa, Israel），如上所述评估活力。精子浓度也使用SpermVisionTM软件（Version 3.8）测定。评估以下活力参数：总活力（TM；精子速度 > 5 μm s?1）和前向活力（PM；精子速度 > 20 μm s?1）。尽管两个实验室使用不同软件系统进行活力评估且存在一些方法学差异，冷冻/解冻匈牙利巨型兔样品在两个实验室使用两种方法分析。两个实验室获得的活力值无差异。因此，两种方法获得的数据被认为可比，包括新鲜精液。活力评估使用苯胺蓝-伊红染色——两个实验室对新鲜和冷冻/解冻样品使用相同的苯胺蓝-伊红活体染色程序。该方法基于伊红穿透质膜受损的精子，导致精子呈粉红色染色，而苯胺蓝提供均匀暗背景。制备苯胺蓝-伊红染液（Aniline SIGMA-Aldrich, Eosin Y Merck, Budapest, Hungary），0.2 g伊红和0.8 g苯胺蓝溶于10 mL改良Lake's稀释液。20 μL染液移入Eppendorf管，随后加入10 μL精子，轻轻混合。随后，10 μL混合物置于显微镜玻片制备涂片，暖风固定。涂片在1200×放大油浸下检查。每涂片评估200个细胞。流式细胞术精子分析——以下分析仅在冷冻/解冻样品上进行，因仅斯洛伐克实验室配备流式细胞仪。精子功能流式细胞术评估按Va?í?ek等和Ku?elová等描述的方法进行，修改以优化家兔精子方案和Hoechst 33342阳性精子设门。样品在染色程序后立即使用CytoFLEX S（Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA）分析，配备近紫外（375 nm, 50 mW）、紫（405 nm, 70 mW）、蓝（488 nm, 50 mW）和红（638 nm, 40 mW）激光器。荧光发射通过三个光学通道检测：FL1（525/40 nm；绿色荧光）、FL6（660/10 nm；DRAQ7远红荧光）和FL12（450/45 nm；Hoechst 33342蓝色荧光）。每样品至少采集10,000个精子，低流速（600–1000 events/s），使用对数信号放大。精子群体使用顺序设门策略识别，包括单细胞和Hoechst 33342设门，以排除碎片、非精子颗粒和细胞聚集体，从而确保分析形态完整的单精子。数据采集使用CytExpert 2.6软件（Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA; 2011–2023），后续数据处理和定量分析使用FlowJo?软件（v10.10.0; BD Biosciences, San Jose, CA, USA）。精子质膜完整性使用SYBR-14绿色荧光（LIVE/DEAD? Sperm Viability Kit, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA）和DRAQ7远红核酸荧光染料（BioStatus Limited, Shepshed, UK）测量。简言之，含1 × 10?精子的精液样品首先与SYBR-14在37 °C暗处孵育10 min。随后不洗涤加入DRAQ7，室温再孵育10 min。流式细胞术分析中不洗涤，质膜完整的精子鉴定为SYBR-14+/DRAQ7?，死精子或膜受损精子鉴定为SYBR-14+/DRAQ7+和SYBR-14?/DRAQ7+。线粒体活性使用MitoTracker? Green FM（Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA）和DRAQ7远红荧光染料检测。含1 × 10?精子稀释于500 μL PBS的精液样品与MitoTracker? Green在37 °C暗处孵育10 min。室温500× g离心5 min后，样品用DRAQ7染色并流式细胞术分析。高线粒体活性在MitoTracker? Green阳性活精子（MitoTracker? green+/DRAQ7?）中鉴定。顶体状态使用花生凝集素（PNA）偶联Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA）评估。含1 × 10?精子稀释于200 μL PBS的精液样品与PNA在室温暗处孵育15 min。室温500× g离心5 min后，样品用PBS洗涤并用DRAQ7染色。流式细胞术分析中，PNA阳性精子分类为顶体受损，包括PNA+/DRAQ7?和PNA+/DRAQ7+群体。胞内活性氧（ROS）使用CellROX Green荧光染料（Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA）检测。含1 × 10?精子稀释于500 μL PBS的精液样品与CellROX在37 °C暗处孵育15 min。孵育后，样品洗涤并用DRAQ7染色，如前所述流式细胞术分析。ROS阳性细胞分类为CellROX+/DRAQ7?和CellROX+/DRAQ7+。本研究中使用的所有荧光染料的最终工作浓度报告于Va?í?ek和Ku?elová等的前期研究。统计分析使用StataNow 19.5软件（StataCorp LLC, College Station, TX, USA）。以百分比表示的数据，统计分析前进行反正弦变换。正态性使用Shapiro–Wilk检验评估。除顶体状态外，所有评估参数均呈正态分布。正态分布数据使用单因素方差分析（ANOVA），随后Tukey事后检验。非正态分布数据使用Mann–Whitney U检验比较两组。多变量方差分析（MANOVA）评估品种×处理交互作用。
研究结果方面，3.1 品种的新鲜精子质量：根据精子存活率评估，新鲜样品中活精子比例匈牙利巨型兔显著高于Chrabrany兔。CASA分析中，匈牙利巨型兔样品的总活力和前向活力均显著高于Chrabrany精液。因此，基于活精子比例、总活力和前向活力，匈牙利巨型兔新鲜精液的初始质量显著高于Chrabrany兔。两个品种间精子浓度未检测到差异，尽管两种检测方法不同。在5 °C平衡60 min后，匈牙利巨型兔主观精子活力为4.4，苯胺蓝-伊红染色评估存活率为94.65%活精子。这些发现表明平衡期间主观精子活力或存活率未发生明显恶化。这些评估仅在匈牙利巨型兔品种进行，因此无相应数据与Chrabrany兔比较。3.2 冷冻/解冻后精子质量：与新鲜样品相反，冷冻/解冻后活精子比例Chrabrany兔显著高于匈牙利巨型兔。总活力和前向活力Chrabrany样品也均显著高于匈牙利巨型兔精液。析因方差分析显示，品种、处理及品种与处理交互作用均对检测的精子参数有显著影响。显著交互作用表明处理效应因品种而异，因此主效应应在该交互作用背景下解释。前向活力观察到显著品种×处理交互作用（F(1, 30) = 146.48, p < 0.00001）。匈牙利巨型兔新鲜精液前向活力高于Chrabrany精液（分别约76% vs. 47%）。冷冻保存显著降低两个品种前向活力，但匈牙利巨型兔样品降低幅度大得多，前向活力降至8.5%，而Chrabrany精液为20.6%。因此，冷冻保存对前向活力的影响品种间差异显著。精子存活率也观察到显著品种×处理交互作用（F(1, 30) = 45.56, p < 0.00001）。新鲜精液中，匈牙利巨型兔存活率高于Chrabrany精子（分别约93% vs. 77%）。冷冻保存后，两个品种存活率均下降，但匈牙利巨型兔精子下降幅度大得多，导致解冻后存活率低于Chrabrany精子（分别约43% vs. 56%）。与前向活力类似，冷冻保存对精子存活率的影响品种间不同。冷冻/解冻样品的流式细胞术分析显示，两个品种间精子质膜完整性或死/膜受损精子比例无显著差异。线粒体活性品种间也相似。相反，顶体损伤匈牙利巨型兔显著高于Chrabrany精液。此外，冷冻/解冻匈牙利巨型兔精液胞内ROS水平显著高于Chrabrany精液。讨论部分总结：除冷冻程序本身造成的损伤（包括热休克、冰晶形成和ROS产生）外，家兔精液冷冻保存还因品种和个体相关冷冻耐受性变异而复杂化。因此，可能需要品种特异性冷冻保存方案，选择有效精液稀释液是重要的第一步。Kubovicova等的综合研究反映了近年来最常用的精液稀释液。然而，比较不同稀释液的有效性困难，因为不同冷冻保护剂与不同稀释液组合使用。此外，稀释液已在不同家兔品种中测试。商业稀释液中，BotuCrio日益流行并已成功用于加利福尼亚和新西兰杂交兔精子冷冻，总活力约50%，但迄今很少用于本土品种。研究人员前期研究中比较了BotuCrio、INRAFreeze和改良Lake's稀释液在匈牙利巨型兔中的有效性。Lake's稀释液通过减少果糖用量改良，导致较低渗透压，使其适用于家兔。使用补充DMSO的改良Lake's稀释液导致冷冻/解冻后精液质量在所测稀释液间无差异。当DMSO替换为甘油（1%）和DMF（4%）时，改良Lake's稀释液导致活、形态正常精子比例和总活力高于BotuCrio。由于改良Lake's稀释液在前次实验中对匈牙利巨型兔最有效，研究人员旨在测试其对另一本土品种的适用性。因此，本研究中，使用相同改良Lake's稀释液和冷冻程序比较匈牙利巨型兔和Chrabrany本土家兔品种的精子冷冻效率，基于常规体外精子质量评估辅以流式细胞术分析。众所周知，家兔品种间精液质量存在显著差异，精液参数可能因品种和基因型而异。基于此，第一步比较两个品种新鲜精液质量。基于活精子比例、总活力和前向活力的初始精子质量Chrabrany显著低于匈牙利巨型兔精液，表明所检品种间存在明显差异。该发现与Kuliková等早期观察一致，其报道斯洛伐克本土品种间新鲜和冷冻/解冻精液质量变异。然而冷冻保存后，模式逆转。上述每个参数Chrabrany显著高于匈牙利巨型兔精液。总活力Chrabrany精液几乎是匈牙利巨型兔精液的两倍（39.2 vs. 20.5%），前向活力Chrabrany精液也显著更高（20.6 vs. 8.5%）。有趣的是，尽管匈牙利巨型兔精子新鲜状态表现更高前向活力，但该明显优势在冷冻保存后未保留。匈牙利巨型兔精液前向活力显著降低，尽管解冻后仍保留相当比例活精子，提示冷冻保存可能损害精子功能 beyond 质膜完整性丧失。这表明Chrabrany品种精子对冷冻保存耐受性优于匈牙利巨型兔。此外，如研究人员前期研究观察，初始质量最高的精液不一定对冷冻保存最抵抗。本研究中观察到的相对低解冻后活力与多个本土家兔品种报道的发现一致。墨西哥Chinchilla家兔精液冷冻保存仅导致9.4%前向活力。Bianca Italiana精液冷冻保存导致40%总活力但仅20%前向活力，与斯洛伐克Pastel rex品种报道值相似（32 TM%, 16 PM%）。相反，新西兰白品系观察到更高活力值，总活力45%和前向活力29%。为探究低前向活力的可能原因并评估细胞损伤程度，对冷冻/解冻精液进行流式细胞术分析。检测参数包括存活率分析、线粒体活性、顶体状态和胞内ROS形成。所测参数中，顶体损伤（72 vs. 45%）和ROS形成（34 vs. 25%）匈牙利巨型兔显著高于Chrabrany精液。与商业杂交兔如新西兰白比较，使用BotuCrio稀释液静态冷冻后报道较低顶体损伤（17.4%）和ROS产生（25%）。这些差异可能提示本土品种对冷冻保存更敏感，这可能与其更大个体变异有关，而杂交兔可能更均匀。冷冻保存后，顶体损伤和ROS产生均可能从约10–15%增加至约40%。精液中高ROS水平可导致氧化应激，可能直接损伤精子、诱导DNA片段化和凋亡、损害精子活力。这些有害效应也可能 contribute to 冷冻/解冻匈牙利巨型兔精液观察到的较低功能质量。总之，这些发现表明两个品种不仅初始精液质量不同，对冷冻保存的反应也不同。两个品种对冷冻保存的不同反应不能仅由精子存活解释。匈牙利巨型兔精液中，尽管活精子比例相对高，前向活力显著降低，提示存活精子的功能能力可能被冷冻显著损害。匈牙利巨型兔精液中观察到的更高顶体损伤和ROS形成进一步支持冷冻保存诱导的细胞和功能损伤 contribute to 解冻后活力显著降低的可能性。研究人员承认相对低解冻后活力和存活率可能限制当前方案的实践应用，其受精能力尚待人工授精试验确认。然而，精液冷冻保存的价值也应从遗传资源保护背景考虑。在此背景下，主要目标不一定是最大化繁殖效率或经济盈利，而是保护遗传多样性和维持未来品种恢复潜力。因此，即使导致次优解冻后精子质量的方案也可能 contribute to 濒危或数量稀少本土品种的保护，前提是其繁殖有效性最终能被证明。结论翻译：总体而言，结果表明改良Lake's稀释液可能也适用于其他家兔品种的精液冷冻保存。同时，本研究揭示了所检两个品种间冷冻耐受性差异，强调开发品种特异性冷冻保存方案的重要性。需要进一步研究包括人工授精试验以验证冷冻保存精液的受精能力并确定所提方案的实际适用性。
