真空辅助超声萃取-高效液相色谱法快速定量三种中药中游离槲皮素的研究

《Separations》：Ultrafast Vacuum-Assisted Ultrasonic Extraction for Quercetin Quantification in Three Herbal Medicines

　　

建立了一种超快速工作流，将真空辅助超声萃取（vacuum-assisted ultrasonic extraction，VAUE）与高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）联用，用于定量测定三七（Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen）、山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）和黄芪（Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge）中的游离槲皮素。研究人员通过单因素实验筛选合适的萃取条件。选定的萃取条件为：60%乙醇作为萃取溶剂，真空辅助超声萃取时间5 min，液固比1:30。对于每份三七粉末样品，从启动超声萃取开始，经离心、过滤和HPLC分离的整个分析流程可在15 min内完成，回收率为78.60%～110.04%。与传统萃取方法相比，VAUE表现出更高的萃取效率和更短的萃取时间。该法相对简单、成本低且条件温和，为三七、山楂和黄芪中槲皮素的高通量定量提供了可能，显示出用于这些药材初步质量评价的潜力，并为药材原料及其衍生物的开发利用提供了技术支持。

现代中药质量控制需要高效、绿色的定量技术。精确测定草药中的特征生物活性成分有利于改进质量评价标准，推动药用资源的标准化利用。槲皮素是一种黄酮类活性成分，在三七（Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen）、山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）和黄芪（Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge）中天然含量极低（<0.1%），且三七中的多糖和皂苷可与槲皮素形成复合物，干扰其分离。传统提取方法如水煎煮、浸渍、渗漉、回流提取、溶剂萃取和水蒸气蒸馏，存在提取时间长、产率有限、杂质洗脱多、热降解和溶剂残留风险等问题。为弥补这些缺陷，本研究采用真空辅助超声萃取（vacuum-assisted ultrasonic extraction，VAUE）与高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）联用，建立了三种药材中游离槲皮素的超快速定量方法。

研究人员通过单因素实验优化了萃取条件，在最优条件下（60%乙醇、提取5 min、液固比1:30）完成样品前处理，整个分析流程（萃取、离心、过滤、HPLC分离）可在15 min内完成。回收率为78.60%～110.04%。与常规提取方法相比，VAUE具有更高的提取效率和更短的时间。该方法简单、成本低且条件温和，适用于三种药材中槲皮素的高通量定量，可为药材质量初步评估提供技术支持，并为药材原料及其衍生物的开发利用提供支撑。

方法学验证方面，研究人员采用Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器（DAD）和C₁₈色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），以乙腈-0.2%磷酸水溶液（50:50，v/v）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长372 nm，柱温30 °C，进样量20 μL。样本来源为：三七购自云南香汇药业有限公司（批号F20211013），黄芪购自中山中智中药饮片有限公司（批号202406025601），山楂购自云南天江一方药业有限公司（批号25110044）。样品粉碎过80目筛后，干燥备用。VAUE操作使用100 mL圆底烧瓶，在?0.08 MPa真空度下进行超声萃取，超声功率120 W，频率40 kHz，温度25 °C。离心和过滤后进行HPLC分析。单因素实验依次筛选乙醇浓度（40%–80%）、萃取时间（5–25 min）和固液比（1:20–1:60）。对比了常压超声萃取（APUE）、真空单独处理、静态浸泡等不同提取方式。

3.1. Validation（方法验证）
通过校准曲线、精密度、重复性、选择性、稳定性、残留效应、耐用性和加标回收实验验证了方法。校准曲线方程Y = ?1.15908 + 1.05948 X，R²=0.99921，线性范围0.6–10 mg/L，检出限（LOD）5.70 μg/g，定量限（LOQ）17.28 μg/g。日内精密度RSD为1.47%，日间精密度RSD为4.27%，提取重复性RSD为1.52%。选择性实验中，空白溶剂无干扰，样品峰紫外光谱与标准品一致，峰纯度因子997，与相邻干扰峰分辨率大于1.5。溶液稳定性实验表明，样品溶液应在制备后4 h内分析，4 h内RSD为4.51%。残留效应可忽略（0.30%和0.26%）。耐用性实验中，保留时间RSD<1.2%，峰面积RSD<2.8%，拖尾因子0.94–1.12，分辨率大于2.5。加标回收率范围为78.60%～110.04%，低浓度水平偏差较大，中高浓度水平准确度和精密度良好。

3.2. Single-Factor Experiment Results（单因素实验结果）
乙醇浓度实验表明，槲皮素提取量在60%乙醇时最高（F = 1538.31，p = 6.74 × 10^?14），超过60%后有所下降，原因可能是溶剂极性降低阻碍槲皮素溶解并溶解更多杂质。萃取时间实验中，5 min、10 min和15 min的提取量无显著差异（F = 27.09，p = 2.40 × 10^?5），20 min后开始下降，25 min显著降低，可能与长时间空化导致槲皮素氧化有关，因此选择5 min作为最佳时间以缩短前处理。固液比实验中，1:30时提取量最高（F = 835.38，p = 1.42 × 10^?12），1:20时溶剂不足，高于1:30后过多溶剂会稀释目标物并共提取干扰杂质，导致检测含量下降。

3.3. Method Comparison（方法比较）
在相同条件下，APUE和VAUE提取的游离槲皮素含量分别为4.346 μg·g^?1和6.717 μg·g^?1（RSD<3.7%，n=5），VAUE显著高于APUE（p < 0.001）。静态浸泡和真空单独处理的信号响应不足，无法准确定量。真空条件可降低氧分压，减少槲皮素氧化降解，同时促进溶剂渗透和细胞内组分释放，从而提高提取效率。

3.4. Preliminary Application（初步应用）
将已验证的方法扩展应用于山楂和黄芪样品。与APUE相比，VAUE使山楂和黄芪中槲皮素提取量分别提高18.93%和12.13%，RSD均小于5%，表明该方法对这两种药材也具有较好的适用性，但需进行基质特异的完整验证才能用于常规定量。

讨论部分总结了VAUE的协同机制：真空与超声联合可增强传质，提高提取效率，缩短提取时间。方法简单、经济、条件温和，适合高通量初步筛查，但仅对游离槲皮素进行了验证，未实现多组分同时测定，且对复杂复方样品和现场快速筛查存在局限。研究结论可翻译为：本研究建立了真空辅助超声萃取结合高效液相色谱的方法，用于快速定量三七中的槲皮素，并对黄芪和山楂进行了探索性应用。该联用策略在15 min内完成提取，显著提高样品检测通量，性能优于传统提取技术，可为草药质量控制和槲皮素相关产品开发提供有前景的技术选择，具有实际应用潜力。