E8E2调控HPV16生产性感染中先于E4表达的E2阳性复制中心形成

《Journal of Virology》：E8^E2 controls the formation of E2-positive replication centers that precede E4 expression during productive HPV16 infection

　　

人乳头瘤病毒（HPVs）将其复制周期与角质形成细胞分化相偶联。病毒基因组在未分化细胞中以低拷贝数维持，并在分化上基层细胞的核复制灶内发生扩增。病毒蛋白E2和E8^E2分别作为病毒复制的激活因子和抑制因子。研究人员使用一种新型多克隆抗血清以及可同时识别E2和E8^E2的单克隆抗体22E2-B9，在携带游离型HPV16野生型（wt）或E8^E2突变基因组的角质形成细胞中鉴定出不同的核内E2灶。这些灶与病毒基因组及细胞蛋白RPA32、RAD51、γH2AX和BRD4共定位，符合病毒复制中心的特征。细胞周期分析显示，E2灶形成于S期（S phase）并持续至G2期（G2 phase）。E8^E2表达或抑制活性缺失可增加复制灶数量并诱导弥漫性核内E2染色。仅一部分E2灶阳性细胞表达晚期病毒蛋白E4，表明复制中心在强晚期基因表达之前出现。在器官型培养中，E2灶阳性/E4阴性细胞在E2灶阳性/E4阳性细胞之前于上基层被检出，而E2阴性/E4阳性细胞提示生产性感染中E2的动态调控。此外，许多wt细胞显示类似E8^E2突变细胞的E2灶表型，提示角质形成细胞分化过程中E8^E2活性下降。这些发现表明，E2阳性病毒复制中心受E8^E2严格调控，在生产性HPV16感染早期出现，并在病毒生命周期生产期伴随E2和E8^E2的动态调节。人乳头瘤病毒（HPVs）将其复制周期与角质形成细胞分化相偶联，但控制生产性病毒基因组扩增的机制仍不完全清楚。在此，研究人员在HPV16感染的角质形成细胞中鉴定出不同的E2阳性核复制中心，并显示这些中心含有病毒基因组以及参与DNA复制和修复的细胞因子。研究人员证明这些结构在S期形成，持续至G2期，并在晚期病毒E4蛋白大量表达之前出现，表明病毒基因组扩增在生产性周期中较此前认识更早启动。研究人员进一步显示，病毒抑制因子E8^E2调控E2阳性复制中心的组织，并且E8^E2活性在角质形成细胞分化过程中似乎下降。总之，研究人员的发现揭示生产性HPV16感染中E2和E8^E2的动态调控，并为分化的上皮细胞中病毒基因组扩增和晚期基因表达如何协调提供新见解。

研究背景与问题：高危型人乳头瘤病毒（HR-HPVs）是肛门生殖道和口咽部恶性肿瘤的致病因素，HPV16是最流行且致癌性最强的型别。HPV感染皮肤和黏膜上皮的角质形成细胞，并将复制周期与感染细胞的分化状态紧密偶联。在基底层的上皮细胞中，病毒基因组以低拷贝数维持，仅早期病毒基因表达，不产生感染性病毒颗粒；感染细胞进入上基层后启动生产期。HPV16 E6和E7癌蛋白诱导细胞周期再进入，表达S期和DNA复制标志物，并调控DNA损伤信号和DNA修复通路。生产期的特征是病毒基因组扩增和分化依赖性晚期启动子激活，后者驱动E1^E4、E5转录本来源的E4蛋白大量表达。病毒基因组扩增发生在核复制灶内，灶内含病毒基因组、病毒蛋白及参与DNA复制和修复的宿主因子，如RPA32、磷酸化H2AX（γH2AX）和RAD51。既有模型认为细胞转录因子激活晚期启动子先于基因组扩增，晚期启动子来源转录本可编码E1和E2复制蛋白并触发扩增，且这些事件主要发生在延长的G2期。E2是序列特异性DNA结合蛋白，识别病毒上游调控区（URR）内E2结合位点，主要功能是招募并锚定病毒解旋酶E1至复制起点；E2也作为转录调控因子，主要通过结合BRD4发挥作用，并参与病毒基因组的核保留和分配。E8^E2是PV表达的抑制蛋白，其E8域替代E2 N端转录激活域，融合至E2 hinge区和DNA结合/二聚化域，因而结合相同E2位点；与E2不同，E8^E2在未分化角质形成细胞中是病毒基因组复制和基因表达的强抑制因子，其抑制活性依赖E8域内保守残基K5、W6、K7，并招募NCoR/SMRT共抑制复合物。缺乏E8^E2表达（E8?）或表达NCoR/SMRT结合缺陷型E8^E2突变体（E8 KWK）的HPV16基因组，在未分化和分化角质形成细胞中均显示病毒基因组拷贝数升高及早期和晚期病毒基因表达增加。免疫组化研究显示HPV16阳性病变中E2蛋白在部分上基层角质形成细胞升高，提示E2参与生产性复制；培养中部分分化HPV16阳性细胞含核E2灶，被认为是病毒复制中心，且wt与E8^E2缺陷细胞中这些结构的组成不同，提示E2和E8^E2可能均存在于复制灶内。但E2和E8^E2在生产性HPV16复制中的精确功能仍不完全清楚。因此，研究人员开展本研究，以解析E2和E8^E2在生产性感染中的作用。研究人员生成针对HPV16 E2 aa202–286的亲和纯化兔多抗pAb 16E2，并结合mAb 22E2-B9，利用稳定维持游离型HPV16 wt、E8?或E8 KWK mt基因组的角质形成细胞系，证明两种抗体可检测小部分细胞中的核E2阳性灶；这些结构含HPV16基因组及RPA32、RAD51、γH2AX、BRD4等复制中心标志物，缺失E8^E2或破坏其抑制功能增加复制灶数量并诱导弥漫性核E2染色；E2灶阳性/E4阴性细胞与E2灶阳性/E4阳性细胞存在空间分离，提示E2阳性复制中心形成早于E4大量表达；器官型培养中大量wt E2灶阳性细胞呈现类似E8^E2突变细胞的表型，提示分化过程中E8^E2活性下降。研究结论强调E2和E8^E2在生产性感染中受动态调控，以协调病毒基因组扩增和晚期基因表达，这对理解HPV生产性复制和晚期基因表达协调具有重要意义。

关键技术方法：研究人员生成并验证针对HPV16 E2与E8^E2共享区域的亲和纯化兔多抗pAb 16E2，并联合mAb 22E2-B9进行免疫印迹、免疫沉淀和免疫荧光；使用既往研究建立的稳定维持游离型HPV16 wt、E8?和E8 KWK mt基因组的角质形成细胞系，并设HK-HPV16 E6/E7和正常人类角质形成细胞（NHK）对照，未涉及患者队列；开展单层培养、甲基纤维素悬浮分化及14天器官型培养；采用HPV16 DNA荧光原位杂交（DNA-FISH）联合免疫荧光、细胞周期标志物共染、全mount免疫荧光和共聚焦三维重建分析。

结果：
1. HPV16 E2 antibodies detect nuclear foci in keratinocytes maintaining replicating HPV16 genomes。研究人员通过免疫印迹、免疫沉淀和免疫荧光验证pAb 16E2与mAb 22E2-B9可检测E2和E8^E2；在HPV16 wt、E8?和E8 KWK mt细胞中，免疫荧光显示小部分细胞含核E2灶。wt细胞多含1–2个离散灶，E8?细胞多含多个灶，E8 KWK mt细胞常见弥漫性核E2染色并伴多灶；E8?和E8 KWK mt中灶阳性细胞比例略增。原文指出不能排除E8^E2缺陷基因组拷贝数较高对灶数增加的贡献。
2. E2 foci colocalize with HPV16 genomes, DNA replication, repair, damage response, and transcription markers。通过HPV16 DNA-FISH联合E2免疫荧光，研究人员发现E2灶与HPV16 DNA信号共定位；与RPA32、RAD51、γH2AX共定位，wt中平均Pearson相关系数（PCC）分别约0.71、0.67、0.77；E8?中E2与RPA32、RAD51、γH2AX共定位显著降低。E2与BRD4在wt中PCC约0.66，E8?中升至约0.78；E2与NCoR和TBLR1在wt中PCC约0.60和0.80，E8?中降至约0.30和0.47。结论为E2灶含HPV16基因组及多种复制、修复和转录调控相关宿主因子；原文强调荧光共定位有技术局限，不应将这些差异解释为复制中心组成或结构的决定性证据。
3. E2 focus-positive cells appear during the S phase and persist into the G2 phase。通过CDT1、细胞周期蛋白A2（CCNA2）和细胞周期蛋白B1（CCNB1）共染及核面积分析，E2灶阳性wt和E8?细胞CDT1水平显著低于邻近E2灶阴性细胞，约70% E2灶阳性细胞呈核内CCNA2染色，>60%呈胞质CCNB1染色，且E2灶阳性细胞核面积显著大于阴性旁邻细胞；结论为E2灶在S期形成并持续至G2期。
4. E2 focus formation precedes high-level E4 protein expression。通过E2与E4双重免疫荧光并按E2或E4先行筛选，单层培养中多数wt（97.3%）和E8?（80.3%）E2灶阳性细胞仅显示E2灶而无E4信号，仅少数wt（2.7%）和E8?（14.3%）细胞同时E2灶阳性和E4阳性；先筛E4阳性细胞时，大量wt（85.0%）和E8?（72.3%）细胞同时显示E2灶和E4。14天器官型培养全mount三维分析显示，E2灶阳性细胞仅见于上基层，E2阳性/E4阴性细胞位于E2阳性/E4阳性细胞下方，E2阴性/E4阳性细胞常位于最上层；结论为E2灶形成是生产性HPV16生命周期早期事件，先于高水平E4蛋白表达，并提示E2在生产性复制中动态调控。
5. A large fraction of wt cells display E2 focus phenotypes resembling E8^E2 mt cells in organotypic cultures。通过器官型培养全mount免疫荧光三维重建，将E2阳性细胞分为1–2个E2灶、>2个E2灶和弥漫性核E2染色三类，并结合E4状态分析。wt器官型培养中，含1–2个E2灶的细胞仅占E2阳性/E4阴性和E2阳性/E4阳性群体的9%和11%，而>2个E2灶者占54%和23%，弥漫性核E2者占37%和66%；该分布明显不同于单层培养中wt细胞多含1–2个灶。E2阳性/E4阴性wt细胞表型类似E8?细胞，E2阳性/E4阳性wt细胞表型更接近E8 KWK突变细胞；wt与E8^E2突变细胞系间差异未达统计学显著。结论提示角质形成细胞分化过程中E8^E2介导的抑制减弱，从而促进病毒基因组扩增和晚期病毒基因表达。

讨论总结：讨论指出HPV复制策略与感染角质形成细胞分化程序紧密相连，未分化基底细胞中基因组低拷贝维持且主要表达早期区，生产性复制发生于分化上基层细胞；E1和E2对HPV DNA复制起始必需，但其生产性复制中的作用了解较少。E2除复制功能外还是多功能转录调控因子，免疫组化显示E2主要在基底上细胞检出，提示其参与基因组扩增和晚期基因表达。本研究用mAb 22E2-B9和新生成多抗识别HPV16 wt及E8^E2突变角质形成细胞中的核E2灶；E2灶与HPV16 DNA及RPA32、RAD51、γH2AX、BRD4等复制工厂标志物共定位，主要见于越过G1期并表达cyclin A2和cyclin B1的细胞，提示生产性HPV16基因组扩增始于S期并持续至G2期。原文讨论认为E2免疫荧光可较DNA-FISH更早检测复制中心，从而识别病毒基因组扩增水平较低的细胞。E2阳性/E4阴性细胞在单层和器官型培养中均被检出，器官型中限于上基层并位于E2阳性/E4阳性细胞下方，提示E2灶形成先于E4大量表达，基因组扩增与高水平E4表达在时间上可分离；原文讨论提及E4积累受翻译后调控，因而E2灶阳性细胞无 readily detectable E4并不必然表示E4不表达。E8^E2通过E8域保守残基招募NCoR/SMRT共抑制复合物，维持未分化角质形成细胞中低病毒基因组拷贝数；本研究中E8?细胞E2灶与NCoR、TBLR1共定位显著降低，与γH2AX、RPA32、RAD51共定位降低而与BRD4共定位升高，提示E8^E2影响复制灶内复制相关与转录相关过程的空间组织。E8^E2缺失还显著改变E2阳性结构形态；器官型培养中多数E2阳性wt细胞呈现类似E8^E2突变细胞的表型，提示角质形成细胞分化和生产性复制过程中E8^E2介导的抑制减弱。原文指出E8^E2活性在分化中下降的机制尚不清楚，HPV16、HPV18和HPV31中E8^E2转录水平在分化后未见实质下降，提示调控可能发生在蛋白稳定性、定位或辅因子可用性水平。E2阴性/E4阳性细胞的存在提示E2蛋白水平在生产性复制晚期、可能于基因组扩增完成后下降。研究结论翻译：这些发现表明，E2阳性病毒复制中心受E8^E2严格调控，在生产性HPV16感染早期出现，并在病毒生命周期生产期伴随E2和E8^E2的动态调节；总之，研究人员的发现表明E2和E8^E2在生产性感染中受动态调控，以协调病毒基因组扩增和晚期基因表达，并为进一步理解生产性HPV复制和晚期基因表达调控机制提供重要线索。