ASFV I73R蛋白作为多功能Zα结构域通过诱导液-液相分离介导Z结合依赖与非依赖生物学功能

《Nucleic Acids Research》：The African swine fever virus I73R protein is a multifunctional Zα domain that mediates both Z-binding-dependent and -independent biological functions through induction of phase separation

　　

非洲猪瘟病毒（ASFV）I73R编码一个仅由Zalpha（Zα）结构域组成的蛋白。本研究分析了其生化性质。互补性方法证明，I73R是一个多功能Zα结构域，兼具Z结合（Z-binding）、B-to-Z转换（B-to-Z conversion）和液-液相分离（LLPS）诱导活性。I73R被证明是比人ADAR1（adenosine deaminase acting on RNA 1）Zα更优的转换器（converter），并且其Z结合位点的Y48I突变后仍保留转换活性。随后，研究人员研究了I73R的生物学功能，得到以下发现：（i）异位表达I73R或Z结合缺陷的突变I73R均以相似程度抑制亚砷酸盐诱导的应激颗粒（stress granules，SGs），且这些蛋白均未定位于该细胞器内。（ii）在ASFV感染细胞中，I73R与双链RNA（dsRNA）、Z-DNA和Z-RNA形成胞质凝聚物。（iii）用编码天然、突变和嵌合形式Zα结构域的序列拯救ASFV I73R缺失，证明I73R通过诱导LLPS介导Z结合依赖性和非依赖性生物学功能。LLPS抑制剂1,6-己二醇（1,6-hexanediol）对ASFV I73R重组株复制的影响进一步支持该结论。本研究进一步证明Zα结构域之间存在功能多样性，并为靶向Zα结构域介导的LLPS、开发能够调控病毒和细胞含Zα结构域蛋白的药物分子提供了新视角。

研究背景与问题：核酸免疫依赖细胞传感器，根据核酸结构、生化修饰、亚细胞定位、序列或构象，将核酸识别为病原相关分子模式（PAMP）或损伤相关分子模式（DAMP）。双链RNA（dsRNA）和双链DNA（dsDNA）主要以右手螺旋A型和B型存在，也存在左手螺旋Z型构象，即Z-RNA和Z-DNA，并参与转录调控、固有免疫和病毒感染。Zα结构域（Zalpha domain，结合Z-DNA/Z-RNA的短翼螺旋-转角-螺旋结构域）除共同具有Z结合活性外，还存在功能差异：部分Zα结构域可结合右手双链螺旋并介导B-to-Z转换（B-to-Z conversion），不同来源Zα结构域可表现为非转换器、弱转换器或强转换器；少数高预测电荷Zα结构域还可介导液-液相分离（LLPS）。迄今仅三种细胞蛋白（ADAR1、ZBP1、PKZ）和三种病毒蛋白（Vv E3、CyHV-3 ORF112、ASFV I73R）的Zα结构域得到表征。ASFV（非洲猪瘟病毒）I73R是唯一仅由Zα结构域组成的蛋白，已知其Z结合活性、对细胞培养中病毒高效复制和猪体内毒力必要，但其是否具有B-to-Z转换和LLPS诱导活性未知。ASFV对养猪业和全球粮食安全威胁重大，因此研究人员以CyHV-3（鲤疱疹病毒3型）ORF112缺失拯救平台和ASFV反向遗传系统，研究I73R是否为三功能Zα结构域及其生物学意义。研究结论表明，I73R是兼具Z结合、B-to-Z转换和LLPS诱导活性的多功能Zα结构域，并通过LLPS介导Z结合依赖和非依赖的生物学功能；LLPS是ASFV复制中I73R功能的关键决定因素。该研究首次深入表征ASFV关键毒力因子I73R的Zα结构域，证明Zα结构域功能多样性，并为靶向Zα介导LLPS开发抗病毒分子提供新视角；论文发表在《Nucleic Acids Research》。

关键技术与样本来源（不超过250字）：以CyHV-3 BAC ORF112缺失株为平台，在CCB细胞中通过同源定向重组（HDR）测试Zα片段拯救病毒生长；以ASFV-GZ（2018年广东猪源分离株）为亲本，在猪骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中通过HDR构建I73R缺失及Zα/IDR替换重组株，并以EGFP/mCherry单细胞分选纯化、测序验证。原核表达纯化I73R及突变体，采用圆二色谱（CD）检测B-to-Z转换。纯化荧光融合蛋白与PEG-6000、ODN 1826、poly(dGdC)或Z-RNA共孵育，以共聚焦显微镜和荧光漂白恢复（FRAP）分析LLPS。HeLa细胞异位表达Zα并用亚砷酸盐诱导应激颗粒（SGs），免疫荧光检测G3BP1共定位。ASFV感染BMDMs后免疫荧光检测dsRNA/Z-NA与I73R共定位；PAMs感染并加1,6-hexanediol后滴定病毒。样本来源包括CyHV-3 FL株（比利时）、ASFV-GZ、40日龄猪BMDMs、PAMs及普通鲤。

主要研究结果：
1. I73R rescues CyHV-3 ORF112 deletion：研究人员将I73R重组片段与CyHV-3 BAC ORF112缺失质粒共转染CCB细胞，发现I73R可拯救ORF112缺失所致病毒生长缺陷，提示其为三功能Zα结构域；全基因组测序验证重组病毒。所得CyHV-3 I73R重组株在细胞中复制低于ORF112 Zα重组株、斑块较小，在鲤中呈高度减毒表型，但作为减毒候选对致死攻击保护较差。
2. I73R expresses stronger B-to-Z conversion activity than Homo sapiens ADAR1 Zα：CD分析显示，I73R对[d(CG)₆]₂的B-to-Z转换强于Hs ADAR1 Zα，且动力学更快；Y48A和Y48I单突变体仍具良好转换活性，Y48I保留转换活性，N44A Y48A双突变体丧失转换活性；基因I型与基因II型I73R自然变异转换性质相似。
3. I73R can perform LLPS：mCherry标记I73R及突变体在PEG-6000、ODN 1826或Z-RNA存在下形成凝聚物；Z-NA诱导的LLPS需要Z结合活性，N44A Y48A在Z-NA诱导下不形成液滴；FRAP显示早期高度动态、后期流动性降低，提示液滴向凝胶样状态转变。
4. I73R mediates LLPS through homotypic protein–protein interactions：GFP与mCherry标记I73R混合后共定位于同一凝聚物；在Z-NA诱导下，I73R与Z结合缺陷变体仍形成共享凝聚物，说明I73R可经同型蛋白-蛋白相互作用介导LLPS，且该作用独立于Z结合活性。
5. I73R can perform LLPS through heterotypic protein–protein interactions：I73R与CyHV-3 ORF112 Zα混合后，在PEG、poly(dGdC)或Z-RNA诱导下形成含两种蛋白的凝聚物；双Z结合缺陷组合在PEG诱导下仍形成凝聚物，而在Z-NA诱导下不形成，提示异型蛋白互作独立于Z结合，而Z-NA诱导的LLPS需要Z结合。
6. Ectopically expressed I73R is not recruited into arsenite-induced SGs and it inhibits the formation of these membraneless organelles：HeLa细胞异位表达I73R及N44A Y48A后，亚砷酸盐诱导SGs，免疫荧光显示两者均不与G3BP1阳性SGs共定位；表达I73R的细胞SG阳性率约56.5%，而同一培养中未表达转基因组约99.3%，Z结合缺陷突变体结果类似，表明I73R以Z结合非依赖方式抑制亚砷酸盐诱导的SGs。
7. ASFV-infected cells overexpress dsRNA that colocalize with I73R：ASFV感染BMDMs 18小时行dsRNA与I73R双免疫荧光，发现胞质dsRNA凝聚物与I73R共定位；对照实验排除二抗交叉反应，提示I73R与部分dsRNA转录本形成核糖核蛋白（RNP）复合物。
8. ASFV-infected cells overexpress Z-NA that colocalize with I73R：ASFV感染细胞中Z-NA与I73R双免疫荧光显示部分共定位；未处理时多数可及Z22表位为Z-DNA，蛋白酶K处理显著增加遮蔽表位信号，DNAse I与RNAse III处理均降低信号，双酶处理消除信号，提示遮蔽表位包括Z-DNA和Z-RNA。
9. Efficient replication of ASFV in cell culture requires a triple-functional Zα domain, with the LLPS induction property being an independent and essential determinant of the phenotype：研究人员构建ASFV ΔI73R及替换E3 Zα、ADAR1 Zα、ORF112 Zα、I73R N44A Y48A、ORF112 IDR、ORF112 IDR-ADAR1 Zα的重组株。生长试验分为高、中、低 fitness：WT、ORF112 Zα、ORF112 IDR-ADAR1 Zα为高；ΔI73R、E3 Zα、ADAR1 Zα为低；I73R N44A Y48A、ORF112 IDR为中。1,6-hexanediol处理后各重组株复制均降至相近低水平，抑制幅度与I73R locus相关，三功能高fitness组在96小时降低约3 log₁₀，支持LLPS为ASFV复制关键且Z结合非依赖的生物学功能。

讨论部分总结：研究人员认为，I73R是首个仅由Zα结构域组成但兼具Z结合、B-to-Z转换和LLPS诱导活性的天然蛋白；其B-to-Z转换强于且快于Hs ADAR1 Zα，病毒Zα结构域在转换活性上呈显著功能多样性。CyHV-3 ORF112 Zα与ASFV I73R reciprocal swapping显示二者为趋同进化获得的功能同源物，但CyHV-3 I73R重组株fitness较低，可能与I73R电荷较低有关。I73R与ORF112 Zα均可经同型和异型蛋白互作形成LLPS凝聚物，并在感染细胞中与dsRNA/Z-NA共定位形成RNP，原文提出这可能是病毒Zα结构域稳定Z-RNA、促进A-to-Z转换并形成RNP凝聚物以抑制细胞传感器检测Z-RNA/dsRNA的免疫逃逸机制。I73R不定位SGs且以Z结合非依赖方式抑制亚砷酸盐诱导SGs，原文将其与LLPS诱导特性相联系。研究还指出，未来需鉴定RNP中的RNA和蛋白组成，并提到基于Apex2的邻近标记实验正在进行。总体而言，LLPS是ASFV复制中I73R功能的关键决定因素，靶向该过程可能为抗病毒分子开发提供方向。

研究结论翻译：总之，本研究首次深入表征了ASFV近期描述的关键毒力因子I73R的Zα结构域。I73R是迄今唯一被描述为仅由Zα结构域组成的蛋白，为在自然分离条件下研究Zα结构域特性提供了独特模型。该研究表明I73R是一个表达Z结合活性、B-to-Z转换和LLPS活性的多功能Zα结构域。研究进一步证明Zα结构域之间存在功能多样性，并为Zα结构域在抑制细胞传感器检测dsRNA中的作用提供了新视角。重要的是，本研究强调LLPS作为ASFV复制过程中I73R功能关键决定因素的主要作用，并为开发针对全球粮食安全最严重威胁之一的抗病毒分子提供了新视角。