基于纳米孔长读长RNA测序的*Theobroma cacao*与*Bacillus subtilis*及*Moniliophthora roreri*互作中防御相关响应的转录组学解析

《Bacteria》：Transcriptomic Insights into Defense-Associated Responses of Theobroma cacao During Interaction with Bacillus subtilis and Moniliophthora roreri

　　

可可（*Theobroma cacao* L.）生产受到由*Moniliophthora roreri*引起的霜荚腐病的严重制约。*Bacillus subtilis*等有益细菌代表了一种有前景的生物防治策略，但其在病原体暴露期间对可可转录响应的影响仍知之甚少。本研究采用Oxford Nanopore长读长RNA测序技术，在田间条件下表征可可果荚对*B. subtilis*、*M. roreri*及其联合应用的转录响应，同时考虑可可遗传背景的影响。差异表达分析基于参考基因组引导的基因计数和FDR控制的统计框架进行。在确证性水平上，九个独特基因在预设对比中显示显著的差异表达。这些基因包括编码RBP45C样RNA结合蛋白、线粒体小热激蛋白、RNA聚合酶II/IV/V共享亚基、LEA14样胁迫相关蛋白、扩展蛋白样蛋白和GTL1样三螺旋转录因子的基因，将处理相关响应与RNA调控、线粒体蛋白质稳态、转录控制、细胞胁迫保护和细胞壁重塑联系起来。单独病原体暴露主要与确证性基因的表达降低相关，而当联合处理与单独病原体暴露比较时，其中若干基因的表达模式发生方向相反的变化。当联合处理与单独*B. subtilis*比较时，较小子集的基因也观察到类似的互反模式。然而，当联合处理直接与未处理对照比较时，没有基因达到确证性差异表达标准。这些发现表明，*B. subtilis*并非均匀增强可可中防御相关基因的表达，而是与*M. roreri*转录响应的微生物环境依赖性重组相关。本研究所鉴定的FDR支持基因为进一步独立验证和未来有益细菌–可可–病原体互作机制研究提供了聚焦的候选基因。

**研究背景与问题**

可可（*Theobroma cacao* L.）是巧克力生产的主要原料作物，具有重要的经济、生态和生物学价值。然而，由半活体营养型真菌*Moniliophthora roreri*引起的霜荚腐病是美洲可可生产中最具破坏性的威胁之一。该病原体具有长达60天的活体营养阶段，在此期间不形成可见繁殖结构，随后进入死体营养阶段，表现为广泛组织定殖和果荚表面产孢。理解可可与*M. roreri*互作的分子机制对于制定有效的病害管理策略和改善作物抗性至关重要。

近年来，可可转录组学研究取得了显著进展，包括转录组图谱构建、胁迫条件下的基因表达分析以及靶向关键调控基因的基因编辑方法。RNA-Seq分析已鉴定了可可对*Phytophthora palmivora*、*Moniliophthora perniciosa*等病原体的差异表达基因和防御通路。然而，关于有益细菌与病原体同时存在时可可转录行为的研究极为有限。植物根际促生细菌（PGPB）如*Bacillus*、*Pseudomonas*等可通过茉莉酸（JA）、乙烯（ET）和水杨酸（SA）介导的信号通路诱导系统抗性（ISR）和系统获得性抗性（SAR）。在可可中，有益微生物作为生物防治剂的应用日益受到关注，但三方互作中可可防御相关的分子机制和差异表达基因仍未充分表征。因此，本研究旨在表征可可转录响应如何根据微生物环境（*B. subtilis*、*M. roreri*或二者联合施用）而变化，同时考虑可可遗传背景差异。

**研究内容与结论**

研究人员在哥伦比亚Tolima省La Monta?ita农场开展田间试验，评估两个可可遗传群体（Forastero Amelonado祖先和Trinitario杂交种）对四种处理（未处理对照T4、单独*B. subtilis* T1、单独*M. roreri* T3、联合处理T2）的转录响应。采用Oxford Nanopore长读长RNA测序技术，在接种后30天采集果荚组织进行转录组分析。差异表达分析使用DESeq2负二项广义线性模型，将遗传群体作为固定协变量纳入设计公式，采用Benjamini–Hochberg程序控制FDR。研究鉴定了113个优先候选基因，其中9个独特基因在五个预设对比中达到确证性差异表达标准（FDR < 0.05）。最重要的发现是：单独病原体暴露主要与确证性基因的表达降低相关，而联合处理与单独病原体暴露比较时，若干基因显示方向相反的互反模式。这表明*B. subtilis*并非均匀增强防御相关基因表达，而是与*M. roreri*转录响应的微生物环境依赖性重组相关。该研究为有益细菌–可可–病原体三方互作的机制研究提供了聚焦的候选基因和概念框架。

**关键技术方法**

研究人员采用Oxford Nanopore长读长RNA测序平台（MinION Mk1C，R10.4.1流动池）对可可果荚组织进行转录组测序，利用Dorado v2.1.1进行碱基识别，NanoFilt v2.8.0过滤低质量读段，minimap2 v2.31将读段比对至Criollo可可参考基因组（GCF_000208745.1）。基因水平计数使用featureCounts v2.1.1，差异表达分析在R环境中使用DESeq2包完成，采用负二项广义线性模型和Wald检验。功能注释通过InterProScan 5和eggNOG-mapper v3.0.0-beta6完成。样本队列来源为哥伦比亚Tolima省La Monta?ita农场的两个可可遗传群体（Forastero和Trinitario），每个文库代表一棵独立树木，RNA从同一树木的三个果荚独立提取后等摩尔混合。

**研究结果**

**RNA提取与转录组测序**：23个条形码标记的树级文库初始处理后包含306,694条主要读段，其中134,514条比对至可可参考基因组（全局比对率43.86%）。16个文库满足预定义的比对质量标准，最终保守分析数据集包含12个树级文库。

**优先候选基因的全局表达模式**：113个独特基因在至少一个对比中达到至少一个预定义证据层级。层次聚类未显示样本根据处理或遗传群体的完全分离，热图用于描述性可视化表达模式异质性而非定义处理特异性基因模块。

**优先候选基因在处理对比中的分布**：T3 vs T4（病原体接种相对于未处理对照）包含最大候选集（53个基因），其次为T2 vs T3（33个）、T2 vs T1（29个）、T1 vs T4（26个）和T2 vs T4（19个）。72个基因（63.7%）仅出现在一个对比中，41个（36.3%）出现在两个或以上对比中。

**处理相关响应的统计证据层级**：五个对比中，18个确证性差异表达事件对应9个独特基因达到FDR控制标准。T1 vs T4包含3个FDR支持基因（均为负效应），T3 vs T4包含7个（均为负效应），T2 vs T1和T2 vs T3分别包含2个和6个确证性基因（均为正效应）。T2 vs T4中无基因达到确证性标准。

**FDR支持的差异表达及跨对比模式**：LOC18611644和LOC18611752在T1 vs T4中显示负效应、在T2 vs T1中显示正效应。6个基因（LOC18607447、LOC18610742、LOC18614068、LOC18605508、LOC18593538、LOC18605356）在T3 vs T4中显示负效应、在T2 vs T3中显示正效应。LOC18608408显示仅局限于T3 vs T4的确证性负效应。

**优先候选基因的功能注释**：候选基因分布于植物防御与生物胁迫、运输与膜过程、转录与染色质调控、氧化还原稳态、RNA加工与翻译、次生代谢、细胞骨架、蛋白质周转、初级代谢与能量、细胞壁与胞外基质、激素信号等广泛功能类别。FDR支持基因的注释产物包括三螺旋转录因子GTL1、扩展蛋白样A1、多聚腺苷酸结合蛋白RBP45C、DNA引导的RNA聚合酶II/IV/V亚基6A、晚期胚胎发生丰富蛋白Lea14-A、线粒体23.6-kDa热激蛋白和含锚蛋白重复域蛋白2A。

**KEGG通路表征与多基因表达模式**：20个KEGG通路满足多基因标准。次生代谢物生物合成在全部五个对比中均有代表且显示混合方向变化。糖酵解/糖异生在三个对比中显示一致增加。淀粉和蔗糖代谢在T3 vs T4中显示一致降低。FDR支持基因在多基因KEGG模式中不常见，淀粉和蔗糖代谢及内质网蛋白质加工含有至少一个FDR支持基因。

**讨论部分总结**

讨论部分构建了包含三个组分的工作模型：第一，*M. roreri*暴露与宿主模块的协调转变相关，包括胁迫保护、RNA代谢、转录调控和细胞壁相关功能；第二，单独*B. subtilis*修饰较小的调控和壁相关基因集；第三，联合暴露与独特的转录状态相关，其中若干FDR支持基因的表达变化方向与单独病原体暴露相反。研究人员讨论了RBP45C样RNA结合蛋白在RNA加工和转录稳定性控制中的作用、线粒体小热激蛋白在蛋白质稳态中的功能、RNA聚合酶II/IV/V共享亚基6A在转录和表观遗传调控中的潜在角色、LEA14样蛋白在细胞保护中的功能、扩展蛋白样A1在细胞壁重塑中的作用以及GTL1样三螺旋转录因子在生长–防御平衡中的调控功能。研究局限性包括未直接量化病害严重度、真菌生物量或组织学进展，每个测序文库来自多果荚RNA池，测序深度不均，以及处理和遗传群体组合的不平衡代表性。

**研究结论翻译**

本研究提供了*Theobroma cacao*、*Moniliophthora roreri*和*Bacillus subtilis*之间互作的转录组学评估。可可遗传背景是全球转录组变异的重要来源，凸显了在估计微生物处理效应时考虑宿主多样性的必要性。在113个优先基因中，大多数仅在一个比较中被鉴定，表明转录响应取决于可可暴露于*M. roreri*、*B. subtilis*、两者还是均无。最强的确证性模式与病原体暴露相关：7个基因在*M. roreri*单独处理中表达低于未处理对照，5个基因在联合处理与病原体单独条件比较时显示互反增加，这些基因涉及RNA调控、线粒体蛋白质稳态、转录控制和细胞胁迫保护。第二种模式区分细菌暴露与联合处理：扩展蛋白样基因LOC18607447、预测的非蛋白质编码转录本LOC18611644和GTL1样三螺旋转录因子LOC18611752在单独*B. subtilis*处理后较低，但在病原体加入后较高。功能注释将这些基因水平观察扩展到防御与生物胁迫、能量与初级代谢、氧化还原稳态、RNA加工、转录与染色质调控、膜运输和细胞壁组织相关过程。总体而言，联合处理未产生防御相关基因的均匀激活，而是*B. subtilis*修饰了与*M. roreri*暴露相关的若干表达模式，产生与微生物环境依赖性重编程兼容的独特转录状态。未来研究应纳入更大测序深度、单果重复、平衡实验组、时序采样和疾病进展及真菌生物量的直接测量。九个确证性基因的独立验证对于确定这些模式是否为可可对病原和有益微生物响应的可重复组分至关重要。