《Grass Research》：Trans-zeatin riboside enhances the physiological and transcriptional recovery of perennial ryegrass following heat and drought stress
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高温和干旱在生産过程中造成的损害程度往往难以预测。本研究以常见冷季型草种多年生黑麦草（Lolium perenne L.）为材料，检测了在高温、干旱及复合胁迫后外源施加反式玉米素核苷（trans-zeatin riboside，t-ZR）的恢复效应。结果表明，
高温和干旱在生産过程中造成的损害程度往往难以预测。本研究以常见冷季型草种多年生黑麦草（Lolium perenne L.）为材料，检测了在高温、干旱及复合胁迫后外源施加反式玉米素核苷（trans-zeatin riboside，t-ZR）的恢复效应。结果表明，高温与干旱的复合影响对植株的损害大于单一胁迫。此外，研究显示施用t-ZR可快速促进胁迫后恢复，显著提高叶片叶绿素含量，并降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。t-ZR处理还提高了相对含水量，降低了相对电导率，并增强了抗氧化酶活性。在分子水平上，t-ZR处理调控了参与叶绿素代谢、抗氧化防御、热激响应及胁迫相关转录因子的关键基因的转录表达，协同促进了多年生黑麦草胁迫后恢复能力的增强。了解不同草种的生长与生理响应将有助于制定有效的管理方案，以改善冷季型草在未来夏季的表现。
研究背景方面，干旱与极端高温是影响植物生长发育的主要非生物胁迫，二者主要通过破坏细胞膜完整性扰乱细胞功能，进而降低产量。自然田间环境中干旱与高温常在夏季同时发生，其复合胁迫的协同损害远重于单一胁迫。多年生黑麦草为广泛栽培的冷季型草种，品质优良、产量高且建植快，但对高温和干旱均较敏感。高温通过产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）和诱导蛋白质变性破坏细胞组分，干扰光合能力并导致代谢失衡；干旱主要通过提高细胞渗透势引起细胞脱水，破坏膨压和细胞壁机械支撑。复合胁迫下，干旱引起的气孔关闭削弱蒸腾降温效应，而高温加剧细胞失水和ROS爆发，导致更严重的膜脂过氧化和代谢紊乱。细胞分裂素（cytokinin，CTK）是促进细胞分裂、调节根系形成并延缓衰老的重要植物激素，还可作为信号分子调控胁迫响应。反式玉米素核苷（t-ZR）是植物体内主要生物活性细胞分裂素之一，作为内源信号分子触发非生物胁迫下的下游转录重编程；外源t-ZR已被证明可增强植物胁迫耐受性。胁迫后恢复是决定植物最终再生能力和生产力的关键生物学阶段，涉及受损细胞结构修复、光合与代谢稳态恢复及细胞氧化还原平衡重建，其调控机制有别于胁迫耐受。迄今多数相关研究仅关注t-ZR在单一胁迫下缓解胁迫或促进恢复的作用，而植物在自然或农业环境中常遭遇复合非生物胁迫。因此，本研究旨在评估外源施加t-ZR能否增强多年生黑麦草在高温与干旱复合胁迫后的恢复，并探索其潜在机制，以期为理解植物胁迫后恢复的生理与分子基础提供见解，并为改善冷季型草夏季表现的管理策略提供依据。
研究人员以多年生黑麦草品种'Esquire'为材料，在石英砂中萌发并置于生长箱培养（16 h光照/8 h黑暗，20 °C/15 °C，相对湿度70%，光合光子通量密度750 μmol·m?2·s?1），苗高5 cm后浇灌半强度Hoagland营养液。播种28 d后设六个处理组：高温+对照（CK）、高温+t-ZR、干旱+CK、干旱+t-ZR、高温+干旱+CK、高温+干旱+t-ZR，每组四个生物学重复。高温胁迫通过转移至38 °C/30 °C生长箱实施，干旱胁迫通过浇灌含20%聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-6000的半强度Hoagland营养液模拟，各胁迫处理持续7 d后恢复至胁迫前标准生长条件进行14 d恢复期。恢复期开始时每容器以根部灌溉方式单次施用150 mL 15 μmol·L?1 t-ZR溶液，CK施用等量不含t-ZR的半强度Hoagland营养液。于激素处理开始后0、3、5、7和14 d采集叶片样品用于生理参数和基因表达分析。主要技术方法包括：表型与株高观测；相对含水量（relative water content，RWC）、相对电导率（relative electrical conductivity，REC）、叶绿素含量、游离脯氨酸、MDA含量及抗氧化酶（超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、过氧化氢酶（catalese，CAT）、愈创木酚过氧化物酶（guaiacol peroxidase，POD））活性测定；总RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测8个候选基因表达，以eIF4A为内参基因，采用2?ΔΔC?法计算相对表达量；IBM SPSS Statistics 20.0进行单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）及Student–Newman–Keuls（SNK）事后检验（p < 0.05）。样本队列来源为本研究自培养的多年生黑麦草'Esquire'品种植株。
研究结果如下：
Effect of t-ZR on perennial ryegrass regrowth post-stress recovery（t-ZR对胁迫后恢复期多年生黑麦草再生长的影响）：通过表型观察和株高测定发现，7 d胁迫导致不同程度叶片损伤，复合胁迫损害最重。恢复期各处理组植株生长呈时间依赖性，但相同胁迫历史下t-ZR处理组恢复启动更早、表现更强，第3天和第5天差异明显。恢复14 d后，高温组t-ZR处理株高22.48 ± 0.32 cm，显著高于CK的19.92 ± 0.03 cm；干旱组t-ZR为21.86 ± 0.30 cm，显著高于CK的19.24 ± 0.11 cm；复合胁迫组t-ZR为21.56 ± 0.17 cm，显著高于CK的18.31 ± 0.38 cm。t-ZR处理还提高了RWC，主要在恢复前7 d作用明显，恢复14 d时各胁迫组t-ZR的RWC均显著高于CK。叶绿素含量在恢复期显著提高，尤其在恢复早期，恢复14 d时各胁迫组t-ZR叶绿素含量均显著高于CK。
Effect of t-ZR on free proline, MDA content, and relative conductivity during recovery of perennial ryegrass after stress（t-ZR对胁迫后恢复期多年生黑麦草游离脯氨酸、MDA含量和相对电导率的影响）：通过测定发现，各胁迫组游离脯氨酸显著积累，随时间逐渐下降，恢复第5天各组接近一致；恢复末期高温和干旱组t-ZR的游离脯氨酸分别比CK低33.3%和23.9%，复合胁迫组无显著差异。t-ZR降低了相对电导率，但仅在恢复末期高温和干旱组差异显著。MDA含量在恢复期各胁迫条件下t-ZR组较CK显著降低，高温组降低69.5%（CK降低55.2%），干旱组降低64.3%（CK降低55.9%），复合胁迫组降低60.4%（CK降低53.2%）。
Effect of t-ZR on antioxidant enzyme activity of perennial ryegrass in the recovery period after stress（t-ZR对胁迫后恢复期多年生黑麦草抗氧化酶活性的影响）：通过酶活性测定发现，恢复期CAT、APX、SOD、POD活性逐渐下降。SOD活性逐渐下降，但复合胁迫下t-ZR处理植株从第3天起维持较高SOD活性，单一胁迫下差异较小。POD活性模式与SOD相似，复合胁迫下t-ZR显著较高，单一胁迫下差异小。CAT和APX活性在复合胁迫下明显高于单一胁迫，t-ZR处理植株APX和CAT活性显著高于CK，尤其在复合胁迫下。
Effect of t-ZR on gene expression of perennial ryegrass in the recovery period after stress（t-ZR对胁迫后恢复期多年生黑麦草基因表达的影响）：通过qRT-PCR分析发现，叶绿素合成基因LpUROD1表达先升后降，t-ZR加速其变化帮助植株更快复绿，但复合胁迫下两组的LpUROD1表达均维持低水平；叶绿素降解基因LpNYC1和LpHCAR在恢复期下降，t-ZR进一步促进LpNYC1快速表达。抗氧化酶相关基因在高温胁迫下均呈先升后降模式，t-ZR组恢复5 d后下降更快；干旱胁迫下LpFeSOD先升后降于7 d达峰，t-ZR组LpMnSOD在前3 d快速升高；复合胁迫下抗氧化基因总体低表达，但t-ZR在第3天显著上调LpMnSOD。LpHSP90-5在高温和复合胁迫后恢复期显著下降，t-ZR进一步抑制其表达，干旱胁迫下先升后降。LpNAC019在高温和复合胁迫下显著上调，t-ZR在高温下进一步增强其表达，复合胁迫下无显著影响，干旱胁迫下下调，表明该基因主要在恢复期作为热胁迫响应基因发挥作用。
讨论部分总结：研究人员探讨了t-ZR处理植株的恢复过程及其能否增强多年生黑麦草在夏季常见高温干旱复合胁迫后的恢复。结果表明t-ZR处理显著加速了高温、干旱及复合胁迫后14 d恢复期内的植株恢复，明显减轻叶片萎蔫并在恢复第3天和第5天促进再生。RWC和叶绿素保持是决定植物胁迫适应性的关键生理因素，细胞分裂素水平与高RWC正相关；本研究中t-ZR显著加速RWC恢复，尤其在复合胁迫下，且前7 d差异最明显，表明t-ZR对RWC的作用在恢复早期尤为重要。高温和干旱造成叶绿体及类囊体片层超微结构损伤，复合胁迫下更严重，显著降低叶绿素含量；t-ZR显著增强恢复期叶绿素含量恢复，复合胁迫下恢复更快。游离脯氨酸积累是抗旱或抗热的代谢指标，在渗透调节和自由基清除中具生理意义；MDA是多元不饱和脂肪酸过氧化的主要产物，破坏膜完整性并增加电解质渗漏。本研究中t-ZR较CK显著降低各胁迫下MDA含量、游离脯氨酸水平和相对电导率，表明t-ZR促进细胞恢复和膜稳定性；随时间推移复合胁迫下MDA、游离脯氨酸和相对电导率仍高于单一胁迫，证实复合胁迫恢复更难。植物通过酶促机制中和ROS、修复氧化损伤并增强抗氧化防御；本研究中复合胁迫下抗氧化酶活性除SOD外显著高于单一胁迫，表明复合胁迫影响更明显；随恢复推进各酶活性快速下降后稳定于低水平，但t-ZR组维持显著较高酶活性，第5天后单一胁迫组与CK差异不显著，表明t-ZR的恢复益处逐渐减弱。基因表达分析显示t-ZR通过调控叶绿素代谢、抗氧化系统和胁迫响应转录途径促进恢复：t-ZR在高温或干旱恢复早期上调LpUROD1、下调LpNYC1和LpHCAR，表明叶绿素快速恢复；复合胁迫下LpUROD1持续低表达，表明叶绿体损伤更严重且不可逆。t-ZR改变LpFeSOD、LpMnSOD和LpCATf表达模式，高温下这些基因先上调后下降，t-ZR组恢复5 d内下降更快；干旱下t-ZR前3 d显著诱导LpMnSOD；复合胁迫下抗氧化基因总体低表达但t-ZR仍在第3天显著提高LpMnSOD。这些转录变化与生理测定中抗氧化酶活性和MDA含量变化一致。LpHSP90-5在高温和复合胁迫恢复期持续下调，t-ZR进一步抑制其表达，提示胁迫诱导的蛋白质损伤修复后对分子伴侣需求降低。LpNAC019在高温和复合胁迫下显著上调，t-ZR在高温下进一步增强其表达，干旱下下调，提示其主要作为热响应转录因子。研究人员指出本研究仅验证有限候选基因而非全基因组转录谱，鉴于生理表型受转录、翻译和翻译后过程共同调控，单基因转录水平与相应生理指标无简单线性关系，但基因表达与生理性状的一致动态模式为t-ZR介导促进恢复提供了转录水平证据。总体表明t-ZR通过调控叶绿素代谢、抗氧化防御和胁迫响应关键基因转录促进多年生黑麦草胁迫后恢复。
研究结论部分翻译：本研究检测了多年生黑麦草在高温、干旱及高温干旱复合胁迫恢复期的生理响应和8个胁迫相关候选基因的表达谱，并表征了外源t-ZR的调控效应。高温干旱复合胁迫对植株生长、细胞膜完整性和光合色素的损害比单一胁迫更严重，导致恢复轨迹更慢。外源t-ZR在所有胁迫条件下均持续加速胁迫后恢复，通过提高叶片RWC和叶绿素水平、减轻膜脂过氧化和电解质渗漏、增强抗氧化酶活性实现。候选基因表达分析表明t-ZR调控参与叶绿素代谢、抗氧化防御和热响应的基因表达动态，这些表达模式与观察到的生理恢复趋势一致，为t-ZR介导的生长康复提供了分子水平证据。值得注意的是，t-ZR的调控效应因胁迫类型而异：单一胁迫下t-ZR对生理参数和基因表达均发挥较强调控作用；在损伤更持久的复合胁迫下，t-ZR主要通过恢复早期上调LpMnSOD增强抗氧化能力以缓解累积氧化损伤。本研究为多年生黑麦草非生物胁迫后恢复的激素调控提供了实验证据，并为受夏季高温和干旱影响地区草坪维护与恢复提供了可选管理策略。然而，本试验采用PEG-6000模拟干旱胁迫，不等同于真实土壤干旱，需进一步田间试验验证外源t-ZR在自然田间胁迫条件下的实际效果。
