总游离DNA（ccfDNA）浓度升高与癌症相关甲基化信号富集及多癌种检测敏感性改善相关

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Rising cell-free DNA level tracks cancer-associated methylation signal and improves multicancer detection

意义：细胞在其生命周期中持续将短DNA片段释放入循环。在癌症患者中，这一总游离DNA（total cell-free DNA, ccfDNA）池升高，且主要来自免疫细胞而非肿瘤本身。因此，预期这种升高会稀释癌症特异性信号，从而妨碍癌症检测。研究人员利用来自1,480名受试者的血液样本显示相反结果：即使在相同癌症分期的患者中，较高的总ccfDNA也与更强的癌症特异性信号和更好的检测相关，尤其在早期肿瘤中，甚至在症状性良性病变中亦然。这些发现提示免疫活性与肿瘤DNA甲基化（DNA methylation）之间存在耦合，并意味着总ccfDNA应被视为用于癌症检测试验基准化的分期非依赖性分层变量。

摘要：癌症患者携带的循环游离DNA（circulating cell-free DNA, ccfDNA）——释放入血的短DNA片段——高于健康人。其中大部分过量并非来自肿瘤本身，而是来自免疫细胞，提示其只会稀释血液样本中少得多的肿瘤来源DNA。研究人员利用一项纳入43家医院1,480名既往未治疗参与者的研究——包括14种癌症类型、覆盖所有分期的患者、良性增生患者和健康志愿者——显示相反结果：随着总ccfDNA升高，携带癌症相关DNA甲基化特征的片段比例富集而非被稀释，且独立于癌症类型、疾病分期以及一组广泛的人口学、临床和技术协变量。事实上，总ccfDNA解释的癌症相关甲基化信号方差高于疾病分期本身。这一基础生物学发现提示免疫细胞活性与肿瘤甲基化之间存在耦合。它还具有实际意义：研究人员显示，ccfDNA浓度升高与更高的癌症检测敏感性相关，即使在疾病分期内也是如此，尤其在早期疾病中——I期敏感性从最低ccfDNA浓度三分位组的0.55变化至最高三分位组的0.85，II期从0.59变化至0.86。这提示ccfDNA浓度应被视为用于癌症检测试验基准化的分期非依赖性分层变量。有趣的是，在症状性良性病变患者中观察到相似行为，提示这是对异常组织生长的更广泛生物学反应，而非恶性肿瘤所独有。

研究背景：细胞生命周期中释放短DNA片段入循环，形成总游离DNA（total cell-free DNA, ccfDNA）；健康个体中ccfDNA主要来源于免疫细胞。癌症患者ccfDNA总量升高，但其中大部分并非肿瘤来源，而是白细胞来源；循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）仅占小部分且随癌种和分期变化。由此产生的问题是：非肿瘤来源ccfDNA升高是否只是背景噪声，是否能在癌种和分期之外提供肿瘤相关信息；若其升高稀释ctDNA，则应降低多癌种早期检测（multicancer early detection, MCED）敏感性。研究人员因此直接检验ccfDNA浓度与癌症相关DNA甲基化信号及检测敏感性的关系，并评估其作为分期非依赖性分层变量的价值。研究开展：研究人员分析EMERGE前瞻性多中心队列，来自印度43家医院，2022年6月15日至2025年2月4日，共1,480名参与者，包括950例初治临床检测的恶性实体瘤（14种）、80例症状性良性病变（76例位于上述14种癌种对应器官）和450名健康对照。主要关键技术方法（≤250字）：EMERGE为前瞻性观察性病例对照研究，样本来源于43家印度医院；血样采集后72 h内中央实验室处理，提取ccfDNA并定量于100–1,500 bp片段；进行靶向酶法甲基化测序，覆盖约550 K基因组区域和3.98 M CpG位点；计算Ge80（每区域中≥80% CpG甲基化的片段比例）、Lt20（<20% CpG甲基化片段比例）及片段组学特征；利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）识别肿瘤组织差异高甲基化区域；训练癌症vs对照及组织来源（tissue-of-origin, TOO）分类器；采用多变量线性和逻辑回归；另分析Bredno et al.、Cohen et al.、Mattox et al.公开初治数据集中的循环突变等位基因频率（circulating mutation allele frequency, cMAF）估计ctDNA fraction。结论意义：ccfDNA浓度与癌症相关高甲基化片段比例（circulating cancer-associated hypermethylated fragments, cCHyF）独立正相关，且与检测敏感性独立正相关，尤其在早期；提示ccfDNA浓度可作为MCED基准化的分期非依赖性分层变量，并解释部分MCED敏感性差异。

结果部分：
Analysis Overview. 研究人员分析EMERGE多中心队列，建立从血样中央处理、ccfDNA定量、靶向甲基化测序、Ge80等区域分数计算、癌症vs对照及14种癌种分类器训练，到TCGA差异高甲基化区域识别的分析流程；结论为后续分析提供了统一框架和癌症相关区域定义。
TCGA-Derived Hypermethylated Regions Are Indeed Cancer-Associated. 通过TCGA肿瘤组织与邻近正常/健康组织比较，识别10,225个肿瘤高甲基化区域，并在ccfDNA队列中验证这些区域平均Ge80分数从健康对照、症状性良性病变、早期恶性到晚期恶性逐步升高，所有分期和癌种与对照显著不同；结论为这些TCGA来源区域确属癌症相关高甲基化区域。
Cancer-Associated Hypermethylated Fragment Fraction Rises With ccfDNA Concentration Within Each Stage. 通过在各分期内按ccfDNA浓度三分位分组，比较10,225个癌症相关区域Ge80平均分数；结论为多数分期内Ge80随ccfDNA浓度三分位升高而升高，健康对照中平坦；全panel约550 K区域Ge80随浓度呈下降趋势，支持该关联为区域特异性而非非特异技术效应；按肿瘤大小分层结果稳健；多变量普通最小二乘回归调整癌种、分期、年龄、性别、体重指数（body mass index, BMI）、烟酒及技术因素后，ccfDNA浓度的独立效应仍显著（P = 1.92 × 10^?36）；ccfDNA单独解释19.1%的Ge80方差，分期单独解释15.2%，二者合计25.6%，加入癌种后29.3%，加入全部协变量后30.9%；结论为ccfDNA浓度与癌症相关高甲基化信号独立相关，且解释方差高于疾病分期。
Rising ccfDNA Concentration Independently Predicts Cancer Detection Sensitivity. 通过随机选取613例癌症和237例对照训练癌症vs对照分类器，在独立验证集337例癌症、213例对照和80例良性样本中于预设99%训练特异性阈值评估检测率；结论为敏感性随ccfDNA浓度升高，分期内三分位多数单调升高：I期从0.55升至0.85，IV期从0.83升至0.88，对照接近零；多变量逻辑回归调整癌种、分期、年龄、性别、BMI、烟酒和技术因素后，ccfDNA浓度对检测率总体效应显著（χ₂ = 10.8, df = 1, P = 0.001），仅分期（P = 0.0025）和年龄（P = 5.7 × 10^?5）也显著；年龄40–50岁敏感性0.63，70–80岁0.85；结论为ccfDNA浓度是检测率的独立预测因子。
The ccfDNA Concentration–Sensitivity Association May Extend Beyond ctDNA Fraction. 由于本队列未直接测ctDNA fraction，研究人员分析三个公开初治数据集Bredno et al.、Cohen et al.、Mattox et al.中ccfDNA浓度与cMAF估计ctDNA fraction，并在前两个数据集中评估分类器敏感性；结论为在样本量允许评估时，I期和II期ccfDNA升高伴随ctDNA fraction稳定或下降；II期三个数据集均至少30例，ctDNA fraction稳定或下降，但Bredno et al.和Cohen et al.分类器敏感性在浓度三分位内呈上升趋势；内部TOO分类器准确率在调整癌种和分期后与ccfDNA浓度无关联（χ₂ = 2.16, df = 1, P = 0.14），进一步调整后仍无关联（χ₂ = 0.58, df = 1, P = 0.44）；提示ccfDNA浓度–敏感性关联不完全由ctDNA fraction增加解释。
Increases in ccfDNA Concentration Are Not Explained by Increases in Clinical Stage or Tumor Size. 通过按分期和肿瘤大小分层比较ccfDNA浓度，并评估检测率与肿瘤大小关系；结论为各分期ccfDNA均显著高于对照；I期中位ccfDNA浓度和四分位距高于II期和III期；肿瘤<2.5 cm者中位浓度和四分位距高于2.5–5 cm及5–8 cm者；检测率随肿瘤大小仅轻微升高，但小肿瘤处出现尖峰；结论为ccfDNA浓度不完全由分期或肿瘤大小解释，是部分独立变量。
Symptomatic Benign Disease Represents an Intermediate State. 通过比较良性病变与健康对照及恶性组的ccfDNA浓度、癌症相关区域Ge80和检测率三分位；结论为良性病变ccfDNA浓度显著高于健康对照但低于恶性，平均Ge80亦显著高于健康对照但低于恶性；良性队列检测率随ccfDNA浓度三分位从0.23升至0.54，但低于相应恶性分期；结论为症状性良性病变构成从健康到恶性的浓度依赖生物连续谱中的中间状态。

讨论部分总结：原文指出ccfDNA浓度并非仅是与肿瘤存在粗略相关的预分析技术变量，而是与肿瘤生物学相关的指标；在大型多中心队列中，ccfDNA浓度与cCHyF独立于癌种、分期和技术变量相关，且解释cCHyF方差高于分期（19.1% vs. 15.2%）。疾病分期、肿瘤大小/体积和ctDNA fraction是常用肿瘤负荷替代指标，但均有局限；ccfDNA浓度在所有液体活检中易得。多数ccfDNA升高来自白细胞，理论上应稀释ctDNA；三个公开数据集显示早期ctDNA fraction稳定或下降，而cCHyF和检测敏感性随ccfDNA升高，TOO准确率与浓度无关，支持该关联不完全由ctDNA fraction增加解释。原文提出可能机制为肿瘤微环境中性粒细胞募集和NETosis（中性粒细胞胞外诱捕网形成），即肿瘤来源细胞因子和促炎信号诱导中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs）释放，NET降解成为ccfDNA来源；同一炎症环境可改变邻近上皮和肿瘤细胞DNA甲基化，从而共同提高ccfDNA浓度和肿瘤高甲基化信号；该假设需通过检测NET标志物、中性粒细胞/淋巴细胞比值及实验干预验证。I期和<2.5 cm肿瘤ccfDNA浓度高于II/III期及中等大小肿瘤，可能反映症状性选择偏倚。临床意义为ccfDNA浓度应纳入MCED检测基准化和验证的分层变量，并可能部分解释不同MCED研究报告的I期敏感性差异；症状性良性病变中的相似关系提示该生物学反应并非恶性肿瘤独有。局限包括病例多为症状性、筛查队列需前瞻验证、ccfDNA提取和定量方法未标准化、机制和因果未确立、ctDNA fraction未在本队列直接评估、部分癌种样本量有限。

研究结论（译）：总之，这些发现将ccfDNA浓度识别为血液中癌症相关甲基化信号丰度的生物学相关因素，且独立于疾病分期；这些发现为理解相似分期肿瘤及不同患者群体间基于甲基化的MCED敏感性差异提供了生物学框架，并提示总ccfDNA浓度可能是用于MCED检测基准化的重要分层变量。