来自Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum的重组α-淀粉酶的克隆、特性分析、热稳定性及脱胶潜能；该酶被固定在磁性纳米颗粒上

《International Journal of Biological Macromolecules》：Cloning, characterization, thermal stability and desizing potential of recombinant α-amylase from Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum immobilized on magnetic nanoparticles

　　

摘要

开发具有更好操作稳定性的可回收酶对于酶辅助的 textile 加工非常重要。本研究评估了固定在二氧化硅涂层磁纳米颗粒上的重组 α-淀粉酶在淀粉水解和纺织品退浆中的应用。该酶在Escherichia coli BL21(DE3)中表达，通过 His-tag 亲和纯化技术进行纯化，并以 3.0 mg mL^-1 的最佳浓度固定。颗粒表征证实了二氧化硅涂层和磁性的可回收性，而傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 结果表明蛋白质与载体结合，但未独立确认是否存在共价连接。对接分析确定了 Ligand 周围的 Asp101、Asp143、Asp192、Ser60、Ser193、His98 和 His347 等位点，而模型预测的结合位点 Lys428 与结合裂隙在空间上分离。在 300 K 下进行的 1 ns 分子动力学模拟显示主链的均方根偏差 (RMSD) 值约为 0.30–0.33 nm，表明存在局部构象效应。米氏方程 (Michaelis–Menten) 回归分析得出游离酶和固定酶的表观 V_max 值分别为 1.93 ± 0.04 和 1.14 ± 0.03 μmol mg^-1 min^-1，K_m 值分别为 3.59 ± 0.20 和 2.31 ± 0.17 mM。固定后，表观 V_max/K_m 比值保留了约 92%。固定酶在 60°C 下 4 小时后仍保持 78% 的活性，最佳 pH 值从 6.0 变为 7.0，并且在 25% 有机溶剂中 60 分钟后仍保留 48–66% 的活性。30 天后的残余活性在 4°C 时为 91.5%，在室温下为 76.3%。经过八次重复使用后活性仍保持在 60.6%，十次使用后为 41.3%，最大退浆效果发生在 60 分钟时。这些发现支持进一步评估这种可磁回收的 α-淀粉酶在纺织加工中的应用。

引言

在工业过程中，相比于传统的化学催化剂，酶的使用日益增加，这主要是因为酶能够以可控且环保的方式催化反应 [1]。最近在酶的组织和固定策略方面的进展旨在降低生产成本、提高催化效率，并生成适合工业应用的结构稳定型生物催化剂 [2]、[3]。纳米技术方法正逐渐被采纳为解决这些挑战的有希望的方案 [4]。将酶固定在支撑材料上可以稳定其构象并提高成本效益 [5]。无机载体如粘土矿物（例如膨润土、蒙脱石）和磁纳米颗粒 (MNPs) 已被广泛研究作为酶的载体 [6]、[7]。纳米颗粒较高的表面积与体积比提高了酶的负载量并改善了活性位点的 acessibility，从而增强了催化性能 [8]、[9]。自由酶存在一些固有局限性，例如对多种变性剂的敏感性、热稳定性较低以及易受降解酶的影响 [10]。

纳米颗粒和酶的构型化学特性有助于提高酶-纳米颗粒结合体的性能 [9]。最常使用的纳米磁性颗粒是磁铁矿 (Fe₃O₄) 和磁赤铁矿 (γ-Fe₂O₃)，因为它们具有低毒性和生物相容性 [11]、[12]。二氧化硅涂层的磁纳米颗粒 (MNPs) 具有更好的稳定性、配体结合能力和生物相容性 [13]。一种有前景的策略是将微生物 α-淀粉酶固定在二氧化硅涂层的氧化铁纳米颗粒上，从而制备出可回收的工业用生物催化剂。已经有多种合成氧化铁纳米颗粒的方法，包括化学法和生物法 [11]、[14]。化学共沉淀法可以在碱性条件下从铁盐制备磁铁矿纳米颗粒，合成参数会影响颗粒的大小和相组成 [15]。反应温度也会影响所得磁铁矿纳米颗粒的物理化学性质，这突显了控制制备条件的重要性 [16]。

淀粉酶是一类重要的工业水解酶 [17]、[18]、[19]。α-淀粉酶可以水解淀粉及相关碳水化合物中的 α-D-1,4 糖苷键，生成较小的分子 [20]。它们被应用于食品、洗涤剂、制药、纺织和造纸等行业 [21]。

在纺织工业中，淀粉酶被用作退浆剂 [22]。在织物制造的初始阶段将淀粉应用于纱线可以确保稳定的高效编织过程 [23]。纤维的原始强度和质量在工业上非常重要，因此淀粉酶可以有效地去除浆料而不损坏纤维 [24]。由于淀粉的高度有序结构，它对酶促降解具有抵抗力，因此需要使用特定的耐热酶来进行有效的水解 [25]。工业纺织品退浆过程可以从高耐热性和在高温范围内具有最佳活性的 α-淀粉酶中获益，这取决于处理条件，使得在苛刻的加工条件下能够高效去除淀粉。来自嗜热微生物（如 Thermotoga petrophila）的耐热淀粉酶在高温下仍能保持显著的催化活性，使其成为工业应用的理想候选者 [26]。然而，由于嗜热微生物的生长要求严格和操作限制，大规模培养它们仍然具有挑战性 [27]。基因工程的最新进展通过提高催化效率、稳定性和表达水平显著增强了酶的性能 [28]、[29]。通过这些方法，可以将目标基因扩增并异源表达，以实现适合工业应用的淀粉酶的高产量 [30]。

最近的研究探索了多种提高 α-淀粉酶性能的策略。这些策略包括对 Priestia megaterium α-淀粉酶进行生物工艺优化以用于面团发酵 [31]，将钙独立的嗜温 α-淀粉酶固定在 Genipin 改性的碳纳米管和二氧化硅载体上 [32]，以及用缩水甘油甲基丙烯酸酯和偶氮/三唑基团对磁纳米颗粒进行功能化以增强酶的稳定性和可重复使用性 [33]、[34]。这些研究确立了重组生产和载体功能化作为现有的策略。本工作结合了生化表征、表观动力学、磁性重复使用以及重组 α-淀粉酶在二氧化硅涂层磁纳米颗粒上的初步纺织退浆和探索性结构建模。

本研究旨在通过表达重组 α-淀粉酶并将其固定在二氧化硅涂层 Fe₃O₄ 纳米颗粒上来评估一种可回收的生物催化剂。比较游离酶和固定酶的性能，以评估其稳定性、可重复使用性和催化效果，并确定进一步开发纺织退浆工艺的需求。

章节片段

生物信息学分析

从 Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum 中获得的 α-淀粉酶序列（GenBank 登录号 AFK86349.1）以 FASTA 格式从美国国家生物技术信息中心 (NCBI) 获取。还获取了各种生物体的蛋白质序列（也以 FASTA 格式），并使用 BLASTp 进行分析以识别同源序列。为了确定不同 α-淀粉酶序列中的保守区域，使用了 CLUSTAL W (v 1.81) 和 CLUSTAL Omega (v 2.0) 生物信息学工具。

序列相似性和系统发育研究

α-淀粉酶的催化区域（GenBank 登录号 AFK86349.1）位于 Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum（菌株 DSM 8691/JW/SL-YS485）的基因组区域 1398768–1404365 之间。保守域分析表明该蛋白属于 AmyAc 超家族。全长参考蛋白的理论分子量和等电点 (pI) 分别为 206,216.04 Da 和 4.52；这一质量尚未通过实验确定。

讨论

固定可以改变酶的活性和稳定性，结果取决于固定策略和载体 [45]。多种因素会影响固定酶的活性，包括酶的类型、激活剂以及载体的大小和结构 [46]。酶的固定可以显著增强生物催化过程，从而生产出具有成本效益的工业产品 [47]。文献表明，固定化的 α-淀粉酶表现出多种显著特性

结论

通过在 EDC 存在的情况下将 α-淀粉酶与二氧化硅涂层的磁纳米颗粒结合，制备出了具有高活性和稳定性的固定 α-淀粉酶纳米复合体。在各种条件下评估了固定 α-淀粉酶的性能，包括 pH 值、温度和反应时间。与游离酶相比，固定 α-淀粉酶表现出更好的热稳定性和 pH 稳定性，对有机溶剂的耐受性提高，且可重复使用性增强。这些特性使得固定化的 α-淀粉酶具有优势.

CRediT 作者贡献声明

Kalsoom Tahir: 数据可视化、方法学研究、数据整理。Saadia Sattar: 原稿撰写、软件处理。Iram Liaqat: 原稿撰写与编辑。Sikander Ali: 内容验证、概念构思。Asad ur-Rehman: 数据验证、概念构思。Shaukat Ali: 数据验证、概念构思。Ikram ul-Haq: Asma Zafar: 软件处理、形式分析。Muhammad Nauman Aftab: 原稿撰写与编辑、项目监督。

写作过程中使用生成式 AI 和 AI 辅助技术的声明

作者使用了 ChatGPT 来纠正语法错误、拼写错误、标点符号问题，并提高整体可读性和语言清晰度。所有使用这些工具生成的内容都经过了作者的彻底审查和修改，作者对文章的最终版本负全责。

利益冲突声明

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