Penaeus vannamei中类似peritrophin的蛋白质PvPT-L1的特性分析：其与Lactiplantibacillus plantarum Ep-M17中的二氢脂酰胺脱氢酶（DLD）的潜在关联，以及对益生菌粘附和免疫调节的作用

《International Journal of Biological Macromolecules》：Characterization of peritrophin-like protein PvPT-L1 from Penaeus Vannamei: Potential association with dihydrolipoamide dehydrogenase DLD from Lactiplantibacillus plantarum Ep-M17 and implications for probiotic adhesion and immune modulation

　　

摘要

益生菌被广泛用于促进Penaeus vannamei的生长和健康；然而，它们与宿主相互作用的分子机制仍不完全清楚。在这项研究中，我们发现了一种类似围食菌因子的蛋白质PvPT-L1，可能是Lactiplantibacillus plantarum Ep-M17益生菌效应的关键介质。全长克隆显示PvPT-L1含有三个典型的几丁质结合域，并与Penaeus japonicus的PT-L1具有高度同源性。PvPT-L1主要在中肠表达，在肝胰腺和前肠也有丰富的转录本。体外结合实验证实，重组rPvPT-L1可以结合几丁质，并与革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌结合。值得注意的是，在HEK-293 T细胞模型中，PvPT-L1显著增强了L. plantarum Ep-M17的肠道黏附能力。针对PvPT-L1的RNA干扰（RNAi）导致了466个差异表达基因，破坏了氧化还原稳态、蛋白质稳态和跨膜运输，表明其在维持肠道屏障完整性方面起着关键作用。通过His pull-down和LC-MS/MS技术，我们鉴定出二氢脂酰胺脱氢酶（DLD）可能是与细菌细胞相互作用的潜在伙伴；这种相互作用通过分子对接、动力学模拟和共免疫沉淀得到了进一步验证。功能上，口服重组rDLD似乎可以减轻肠道上皮细胞的凋亡。有趣的是，尽管rDLD抑制了血细胞的吞噬活性，但它有效地重新编程了免疫效应因子的转录，减轻了病原体诱导的凋亡，表明其作用从强烈的内化转变为平衡的免疫调节。总的来说，这些发现为DLD–PvPT-L1轴提供了一个新的视角，可能将物理黏附和免疫调节联系起来，为甲壳类动物中益生菌–宿主免疫相互作用提供了新的机制线索。

引言

Penaeus vannamei是全球最重要的养殖虾类，年产量超过340万吨，多年来一直保持在水产养殖物种中的领先地位[1]。然而，随着全球人口的持续增长，当前的水产养殖规模不足以满足未来的需求。此外，频繁的疾病爆发严重阻碍了大规模集约化养殖的发展，导致抗生素等化学物质的过度使用。这种过度使用带来了病原体耐药性和化学残留物的风险[2] [3]。因此，虾类养殖的可持续发展至关重要。

益生菌被定义为能够为宿主带来健康益处的活性微生物补充剂，是控制传染性疾病的一种有前景的替代策略[4] [5]。随着对可持续和环保养殖实践的重视增加，益生菌的应用受到了学术界的广泛关注[6] [7] [8]。在宿主胃肠道内，益生菌通过多种相互关联的机制发挥其益处。首先，它们通过竞争性排斥病原体，使其无法附着在消化部位和获取营养资源[9] [10]。其次，它们合成抗菌化合物，包括有机酸和细菌素，直接抑制病原体的生长[11] [12]。第三，它们调节肠道微生物群的组成和稳定性，从而将失衡的生态系统恢复到平衡状态[13] [14] [15]。总的来说，这些机制阻碍了肠道病原体的定植和增殖。实证研究表明，益生菌的施用能有效减少有害细菌（如Vibrio parahaemolyticus和Pseudomonas属）的数量，同时促进共生细菌（如Lactobacillus和Bifidobacterium）的增殖，尤其是在水生动物中[16] [17] [18] [19] [20]。显然，这种调节优化了肠道微生物的组成，从而增强了肠道屏障的完整性和功能，进而增强了宿主对肠道感染的抵抗力。

作为营养物质消化和吸收的关键接口，肠道不仅是一个消化器官，还是抵御病原体入侵的重要免疫屏障[21]。肠道黏膜屏障由机械、化学、免疫和微生物成分组成[22]。其中，围食膜（PM）是无脊椎动物中的关键物理屏障，将中肠上皮与摄入的物质隔开[23] [24] [25]。具体来说，PM是一种膜结构，将摄入的食物包裹在肠腔内，主要由糖蛋白和蛋白多糖组成，与几丁质纤维网络交织在一起。几丁质结合蛋白（CBPs）是PM结构完整性的核心，其特征是一个或多个几丁质结合域（CBDs）[26]。值得注意的是，CBDs连同几丁质酶、PM蛋白和凝集素几乎存在于所有无脊椎动物的肠道中[27]。虽然PM蛋白最初是在昆虫中发现的，并因其促进消化和防御外来微生物感染的双重作用而受到广泛研究[27] [28]，但后来研究扩展到了甲壳类动物。最近的研究表明，虾类具有与昆虫中类似的PM结构和蛋白。例如，在P. vannamei中鉴定了几种与白斑综合症病毒（WSSV）包膜蛋白相互作用的肠道PM蛋白，表明它们参与了病毒感染过程[29]。类似地，在Exopalaemon carinicauda和Marsupenaeus japonicus中发现的PM样蛋白也被认为与WSSV的致病机制有关[30] [31]。除了肠道上皮，虾类中的PM蛋白表达不仅限于肠道；某些异构体在肠道外组织中也持续表达。例如，在Fenneropenaeus chinensis中发现的PM样蛋白在卵巢组织中表达，并具有结合细菌和几丁质的能力[32]。

尽管关于甲壳类动物围食膜（PM）的结构组成和几丁质结合特性的研究越来越多，但特定PM相关蛋白的功能作用，尤其是那些参与介导益生菌–宿主相互作用的蛋白，仍然很大程度上未被探索。值得注意的是，我们的初步研究表明，L. plantarum Ep-M17显著上调了P. vannamei中的围食膜因子PvPT-L1。为了填补这一空白，本研究旨在表征PvPT-L1在益生菌–宿主相互作用中的潜在功能机制。具体来说，我们克隆并表达了重组PvPT-L1，以系统评估其在肠道黏膜屏障功能中的作用，包括其几丁质结合亲和力、其与候选益生菌表面成分（如二氢脂酰胺脱氢酶DLD）的潜在相互作用，以及其对L. plantarum Ep-M17在肠道中的黏附和定植的贡献。最终，这项研究试图揭示PvPT-L1可能促进益生菌定植和宿主免疫调节的潜在分子机制，为优化虾类养殖中的益生菌应用提供初步的机制见解。

章节片段

伦理批准和动物福利

所有程序均得到了宁波大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并符合国家关于实验动物的规定。实验在宁波大学动物实验中心进行。采样前用乙醚麻醉小鼠，并尽力减少疼痛和痛苦。

实验材料

健康的P. vannamei个体，初始体重为10.0 ± 0.5克，来自象山水产科技有限公司（宁波，

PvPT-L1的分子特征

多序列比对和系统发育分析

多序列比对显示PvPT-L1的ChtBD2结构域具有高度

讨论

围食膜（PM）是节肢动物抵抗肠道病原体的主要物理屏障[37] [38] [39]。在P. vannamei中，PM的形成主要由围食菌因子（PTs）介导。这些是由中肠上皮细胞分泌的几丁质结合蛋白，提供结构支持和免疫防御。然而，如PvPT-L1这样的具体分子成分尚未完全被鉴定。在本研究中，我们克隆并表征了PvPT-L1，

结论

本研究确定PvPT-L1是将L. plantarum Ep-M17的黏附与P. vannamei的宿主免疫调节连接起来的潜在分子桥梁。我们提供证据表明，PvPT-L1可能与细菌的表面相关蛋白二氢脂酰胺脱氢酶（DLD）相互作用，这种相互作用可能会重塑宿主防御机制。尽管重组DLD（rDLD）减少了血细胞的吞噬作用，但它同时减轻了病原体诱导的凋亡并平衡了免疫基因

CRediT作者贡献声明

杜阳：撰写原始草案、项目管理和资金获取。杨雪：撰写原始草案、项目管理和资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的会影响到本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：42376104）和宁波市科技创新2035关键研发项目（2024Z279）的支持。

杜阳|李斌|杨雪|陈勇