《Industrial Crops and Products》：Laccase elicitation of
Cannabis sativa L. cell cultures induces transcriptional changes and enhances cannabisin biosynthesis
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真菌漆酶（laccase）对Cannabis sativa L.细胞悬浮培养物产生了诱导响应。RNA-Seq分析揭示了诱导响应的早期和晚期阶段。漆酶处理后，苯丙烷类（phenylpropanoid）途径相关基因及cannabisin含量均有所增加。漆酶为研究和
真菌漆酶（laccase）对Cannabis sativa L.细胞悬浮培养物产生了诱导响应。RNA-Seq分析揭示了诱导响应的早期和晚期阶段。漆酶处理后，苯丙烷类（phenylpropanoid）途径相关基因及cannabisin含量均有所增加。漆酶为研究和强化代谢产物生产提供了一种简便工具。
研究背景：Cannabis sativa L.是一种多用途植物，可产生纤维素纤维及包括cannabinoids、terpenes和phenolics在内的生物活性次生代谢产物，具有抗氧化、抗炎和抗癌等生物活性，在化妆品和制药领域具有应用前景。传统植物栽培受生长周期、环境条件和季节性等因素限制。植物细胞悬浮培养（cell suspension culture）为标准化和连续生产生物活性植物化学物提供了受控培养系统。诱导（elicitation）是增强植物细胞培养物中次生代谢产物生产的关键策略，诱导子可分为生物诱导子（包括病原体及微生物来源分子）和非生物诱导子（如盐度、温度、UV辐射或重金属）。在C. sativa中，已有研究使用methyl jasmonate、salicylic acid或真菌提取物等诱导子刺激次生代谢产物生产。然而，关于微生物细胞壁降解酶作为诱导子的研究相对有限。真菌氧化还原酶可修饰胞外酚类化合物和胞外氧化还原环境，潜在产生氧化信号激活防御响应和次生代谢。本研究假设来自Trametes versicolor的商品化真菌漆酶（laccase）可诱导C. sativa细胞悬浮培养物产生转录和代谢响应，特别是通过激活氧化和苯丙烷途径。研究目标为探究纯化漆酶是否可作为C. sativa细胞悬浮培养物的诱导子并影响次生代谢产物特别是cannabisin的生产。
关键技术方法：研究人员利用先前建立的C. sativa基因型Line 43/178细胞悬浮培养体系，在指数生长末期（继代培养后9天）以20 U/100 mL的T. versicolor漆酶进行诱导处理，设置对照（CTRL）和诱导组，收集H0、H6、D1和D3四个时间点的三个生物学重复。通过RNA-Seq进行转录组分析，差异表达contig筛选标准为FDR校正p < 0.005且最大倍数变化绝对值 > 10。采用qPCR对12个基因进行验证。通过分光光度法测定总酚含量（TPC）和铁还原抗氧化能力（FRAP）。利用非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）分析cannabisin积累。通过光学显微镜观察细胞形态并测量细胞面积。
研究结果：
3.1 诱导后不同时间点的RNA-Seq分析：诱导在培养9天后进行，对应指数期末。RNA-Seq在H0、H6、D1和D3四个时间点进行，筛选出1446个差异表达contig。qPCR验证相关系数为0.944，表明RNA-Seq数据可靠。PCA分析揭示5个明显分离的组：第一组包括CTRL H0-H6-D1及Lac H0；第二至第四组分别包括Lac H6、Lac D1、Lac D3的生物学重复；第五组包括CTRL D3重复。层次聚类（HC）鉴定出8个主要簇，其中簇1、4和8包含最多contig（分别为332、256和438）。根据表达趋势可区分三种主要转录模式：早期响应（H6，簇4、6、8）、中期响应（D1，簇3、5）和晚期响应（D3，簇1-2）。
3.2 基因本体论富集分析：簇4、6、7和8在生物学过程方面显示GO富集，簇1、2和5在KEGG通路方面显示显著富集。簇1富集于次生代谢产物和苯丙烷生物合成相关KEGG通路，包含CCoAOMT1、多个CYP450家族成员及LAC7等基因。簇2富集于其他聚糖降解和diterpenoid biosynthesis（与赤霉素代谢相关），包含木葡聚糖代谢相关基因、CSLG3、多聚半乳糖醛酸酶及GA3OX等。簇4富集于木质素代谢相关生物学过程，包含PAL、LAC7、CAD、PER、GST及酪氨酸脱羧酶等基因。簇5富集于苯丙烷（即flavonoid）生物合成相关KEGG通路，包含PAL2、CAD、HCT、TT7及萜烯合成酶等基因。簇6富集于细胞对缺氧响应和化学刺激响应相关生物学过程，包含SRO5、ACD1-LIKE、thaumatin超家族成员及钙结合蛋白等。簇7富集于胁迫和防御响应相关生物学过程，包含WRKY家族转录因子、AP2/ERF结构域蛋白及LOX3等。簇8富集于细胞壁生物发生和组织、碳水化合物代谢及H2O2代谢过程，包含GAUT15、PME3、XTH5-9-15-32、EXPA3-4-5及过氧化物酶等基因。
3.3 漆酶诱导对总酚含量和抗氧化能力的影响：漆酶诱导对TPC有显著影响，H6和D1时间点诱导组TPC高于CTRL。抗氧化能力方面，漆酶诱导导致数值下降。CTRL条件下，D1和D3的TPC和抗氧化活性显著高于H0和H6。诱导条件下，D1的TPC显著高于H0和H6；H0的抗氧化能力显著高于H6和D3。
3.4 漆酶诱导对cannabisin积累的影响：非靶向代谢组学显示cannabisin D和F的丰度变化。cannabisin D及其衍生物的信号强度平均高于cannabisin F及其衍生物。在D1和D3，漆酶诱导组cannabisin D信号强度高于CTRL，倍数变化分别为2.4和5.4；cannabisin F信号强度高于CTRL，倍数变化分别为4.6和5.3。
3.5 诱导后细胞形态学分析：CTRL细胞通常较大且更细长，漆酶处理细胞较小且呈更圆的形态。CTRL细胞平均面积为2357.5（±655）μm2，诱导细胞为1070.6（±374）μm2（n = 20）。
讨论部分总结：本研究旨在探究C. sativa细胞悬浮培养物对纯化真菌漆酶作为诱导子的转录组响应及其对cannabisin相对积累的影响。诱导在指数生长末期（继代培养后9天）进行，漆酶浓度为20 U/100 mL（0.2 U mL?1），显著低于Cardullo等（2016）用于体外氧化偶联的浓度。转录组响应表明细胞重编程，代谢通量转向苯丙烷代谢。簇1和簇5均包含苯丙烷和次生代谢途径激活相关基因。PAL2（FC Lac D1 vs CTRL D1 = 144.7）、CCoAOMT1（FC = 3.5）、CAD（FC = 46.2）、HCT（FC = 14.3）、CYP450（FC ≤ 14.8）和flavonoid hydroxylases（FC ≥ 213.5）的富集表明诱导不仅影响生物合成还影响酚类代谢多样化。簇2在H6的显著下调表明细胞壁动态和激素介导生长的早期抑制，与生长-防御权衡一致。显微观察与诱导细胞面积较小一致。簇4显示防御相关途径激活，包括PAL（FC Lac H6 vs CTRL H6 > 18）、CAD（FC > 500）、PERs（7个contig，诱导倍数2-46.8）和GSTs（16个contig，诱导倍数4.5-56.5）。簇6显示漆酶诱导未均匀激活胁迫相关途径而是抑制了缺氧响应和信号传导相关基因子集。簇7转录因子行为表明漆酶诱导重塑了胁迫相关调控网络，WRKY46、WRKY70和WRKY53同源物在CTRL条件下诱导倍数（3-16，D1 vs H0）明显高于漆酶处理（0.3-1.7，D1 vs H0）。簇8证实细胞壁扩展/重塑相关基因下调，EXPA和XETs/XTHs抑制（2.9 ≤ FC CTRL H6 vs Lac H6 ≤ 17.8）与细胞扩展减少一致。H2O2相关本体也在簇8中体现，7个过氧化物酶contig在诱导后均下调（3.6至67倍），而簇2和4中漆酶基因在诱导后上调（139至1780倍），表明酚类氧化过程在诱导条件下发生重构而非氧化酶均匀调控。分光光度和非靶向代谢组学数据进一步支持漆酶诱导下苯丙烷代谢转变。TPC增加伴随抗氧化活性下降反映这些化合物氧化状态改变，与酶促氧化和转化为低氧化还原活性形式一致。结论：漆酶诱导引起快速协调的转录重编程，使Cannabis细胞悬浮培养物转向防御主导代谢，特征为氧化酶基因选择性调控、苯丙烷和木质素相关途径激活及酚类转向特化代谢产物即lignanamides cannabisins。外源酶在液体培养中的应用需仔细优化，酶稳定性可能受培养条件影响， prolonged catalytic activity可能引起过度氧化胁迫或损害细胞生长。结果支持一个模型：外源漆酶氧化培养基中可溶性酚类底物和/或细胞壁相关酚类组分，产生自由基可进行偶联反应并改变胞外氧化还原环境和壁结构，这些变化可能被细胞感知并启动胞内信号传导，导致苯丙烷代谢相关基因激活，前体可利用性增加和氧化活性提高与诱导后cannabisin相对积累增加一致，同时细胞壁扩展相关基因抑制与处理后细胞尺寸较小一致，表明从生长向防御相关代谢转变。
