紫苏源还原性土壤消毒通过富集Bacillaceae和Chaetomiaceae并重构病害相关微生物网络缓解连作障碍

《Industrial Crops and Products》：Perilla-derived reductive soil disinfestation is associated with the enrichment of Bacillaceae and Chaetomiaceae and the restructuring of disease-related microbial networks to alleviate Panax ginseng continuous cropping obstacles

　　

C. A. Mey.因其丰富的生物活性化合物种类及较高的药用和经济价值而成为重要药用作物。其药用和经济价值来源于次生代谢产物——人参皂苷、黄酮类和多糖类，这些成分具有显著的抗癌、抗氧化和抗炎活性。然而，人参的可持续栽培受到连作障碍的严重制约。该问题主要与土壤性质变化、自毒化合物积累以及微生物群落结构紊乱有关。这些变化可改变土壤微生物可利用的生态位，并可能有利于包括Fusarium spp.在内的土传病原菌的持续存在或富集，同时降低潜在有益微生物类群的相对丰度。土壤环境和微生物组的这种耦合变化被认为是连作条件下人参生长、根系健康和生产力下降的重要组成部分。尽管相关研究持续开展，但将土壤条件改变与病原菌相关微生物演替及群落组装联系起来的过程仍未被完全理解，这极大地阻碍了缓解连作障碍技术的发展。还原性土壤消毒（RSD）是一种种植前土壤管理方法，包括有机底物混入、灌溉至水分饱和以及塑料薄膜覆盖。以往研究已将这一过程与pH、养分有效性、发酵来源代谢物以及土壤微生物群落组成的变化联系起来，这些变化均可能有助于降低土传病原菌的发生。大量研究表明，RSD改变土壤肥力、理化条件和病原菌相关微生物群落，从而有助于建立更有利的土壤生态系统。然而，当前RSD应用主要局限于设施蔬菜、水果和一年生药用植物的土壤修复，对人参等多年生药用作物的探索不足。特别是，RSD引起的连作人参土壤变化是否不仅涉及分类组成的变化，还涉及微生物组装过程、预测功能谱和共现模式的变化，以及这些变化与后续植物表现的关系，仍不清楚。因此，扩展RSD应用在应对人参栽培连作障碍方面具有显著潜力。值得注意的是，RSD处理过程中混入不同有机底物可因底物特异性特征而产生不同结果。因此，选择合适的有机底物对于优化特定种植体系中的RSD性能十分重要。RSD通常依赖易降解有机底物，包括作物残体、乙醇和粪肥，而具有生物活性化合物的药用植物鲜有探索。紫花苜蓿（Medicago sativa L.）和紫苏（Perilla frutescens L.）在中国北方广泛种植。紫花苜蓿主要作为饲草和绿肥作物种植，而紫苏作为药用和食用作物使用。二者均具有高度适应性、高产和大量生物量，并在某些农业体系中用作绿肥。此外，二者均已被证明含有丰富的易分解有机碳源并具有强效抗真菌活性。总体而言，这些特性使紫花苜蓿和紫苏成为RSD有前景的有机底物，具有帮助抑制土传病原菌并支持可持续种植体系更健康土壤的潜力。基于这一框架，研究人员提出三个机制导向的假设。第一，研究人员假设综合RSD处理将改变土壤理化条件和资源有效性。这些变化将与土传病原菌相对丰度降低和根病发生率下降相关。第二，研究人员假设以紫花苜蓿和紫苏为底物的RSD将对土壤微生物群落施加不同的环境选择压力。这将以不同方式影响细菌和真菌群落的结构与组装以及共生网络模式。第三，研究人员假设底物引起的土壤养分和微生物群落结构变化将与随后的人参生长、根系健康和人参皂苷积累相关。为验证这些假设，研究人员在连作人参田中进行RSD田间试验，使用紫花苜蓿和紫苏作为有机底物。研究人员系统评估土壤理化性质、酶活性、微生物群落组成、功能谱和共现网络，并进一步使用多变量分析和路径分析检验这些指标与人参生长表现之间的关系。

研究背景： C. A. Mey.因其丰富的生物活性化合物（人参皂苷、黄酮类和多糖类）及显著的抗癌、抗氧化和抗炎活性而具有重要的药用和经济价值。然而，连作障碍严重制约人参可持续栽培，其主要与土壤性质变化、自毒化合物积累和微生物群落结构紊乱有关，这些变化可有利于Fusarium spp.等土传病原菌的持续存在或富集，同时降低潜在有益微生物类群。尽管相关研究持续开展，但将土壤条件改变与病原菌相关微生物演替及群落组装联系起来的过程仍未被完全理解，极大阻碍了缓解连作障碍技术的发展。还原性土壤消毒（RSD）是一种种植前土壤管理方法，包括有机底物混入、灌溉至水分饱和和塑料薄膜覆盖，已被证明可改变土壤肥力、理化条件和病原菌相关微生物群落。但当前RSD应用主要局限于设施蔬菜、水果和一年生药用植物，对人参等多年生药用作物探索不足，特别是RSD引起的连作人参土壤变化是否涉及微生物组装过程、预测功能谱和共现模式的变化及其与植物表现的关系仍不清楚。此外，不同有机底物可因底物特异性特征产生不同结果，而具有生物活性化合物的药用植物作为RSD底物鲜有探索。紫花苜蓿（Medicago sativa L.）和紫苏（Perilla frutescens L.）在中国北方广泛种植，二者均具有高度适应性、高产、大量生物量、丰富易分解有机碳源和强效抗真菌活性，是RSD有前景的有机底物。基于此，研究人员提出三个假设：综合RSD处理将改变土壤理化条件和资源有效性并与土传病原菌相对丰度及根病发生率降低相关；不同底物RSD将对土壤微生物群落施加不同环境选择压力并以不同方式影响细菌和真菌群落结构、组装及共生网络模式；底物引起的土壤养分和微生物群落结构变化将与随后人参生长、根系健康和人参皂苷积累相关。为验证这些假设，研究人员在连作人参田中进行RSD田间试验，使用紫花苜蓿和紫苏作为有机底物，系统评估土壤理化性质、酶活性、微生物群落组成、功能谱和共现网络，并使用多变量分析和路径分析检验这些指标与人参生长表现的关系。研究表明，基于紫苏的RSD将人参根病发生率从100%降至20%，富集Bacillaceae和Chaetomiaceae并抑制Fusarium，有效氮和钾是微生物群落转变的关键驱动因子，基于紫苏的RSD重构微生物网络并提高模块化，增强土壤肥力、生长和人参皂苷积累，表明基于紫苏的RSD是改善连作人参土壤健康的有效策略。

关键技术方法：研究人员在吉林省抚松县（42.40°N，127.09°E，海拔410 m）建立田间试验，试验田2017–2021年种植人参且根腐病发病率达90%，设CK（不处理）、AL（混入15 t·ha^?1紫花苜蓿）、PE（混入15 t·ha^?1紫苏）三个处理，每处理4个独立田间小区，2022年6月30日启动RSD，土壤饱和后覆盖0.1 mm塑料薄膜28天，随后采集0–20 cm土壤；采用16S rRNA基因V3-V4区和ITS区扩增子测序（Illumina MiSeq平台，数据提交NCBI SRA数据库PRJNA886467）；生物信息学分析使用QIIME v1.9.1、UPARSE（97%相似度）聚类OTU，SILVA v138和UNITE v8.0数据库注释，开展多样性、PERMANOVA、PERMDISP、LEfSe、FEAST、βNTI、RCBray、SparCC网络、FAPROTAX和FUNGuild功能预测及偏最小二乘路径模型（PLS-PM）分析；测定土壤理化性质、酶活性并构建土壤质量指数（SQI）；评价人参根系性状、根腐病发病率和病情指数，采用HPLC测定人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rd含量。

研究结果：
3.1 土壤性质和酶活性：PE处理显著提高土壤pH；AL和PE均提高电导率（EC），PE增幅大于AL；两种RSD处理均显著提高有机质（OM）；PE的有效氮（AN）和有效钾（AK）高于CK和AL，AL的AK较CK降低；两种处理的有效磷（AP）均显著下降；URE、PHO和SUC活性在RSD后均低于CK，PE的PHO和SUC低于AL；CAT活性以AL最低；LAC变化不大；AL显著降低SQI，CK与PE的SQI相近，表明PE对整体土壤质量无显著提升作用。由此得出RSD对土壤性质的影响具有底物依赖性和选择性。
3.2 土壤微生物群落丰富度和多样性：与CK相比，AL和PE均降低细菌和真菌Shannon指数，AL降幅大于PE；Simpson指数细菌无显著差异，真菌AL升高；ACE和Chao1丰富度指数在两种RSD处理下均降低，AL低于PE；覆盖度AL高于CK和PE。由此得出RSD降低微生物多样性和丰富度且AL影响更强。
3.3 土壤微生物群落组成和组装过程：基于Bray-Curtis的NMDS显示CK、AL、PE间细菌和真菌群落明显分离，PERMANOVA表明细菌（R²=0.61，P=0.002）和真菌（R²=0.84，P=0.002）群落组成差异显著；PERMDISP显示细菌群落多变量离散度差异显著（F=38.845，P=0.0001），真菌无显著差异（F=0.5917，P=0.5794），故细菌PERMANOVA结果需谨慎解释。Proteobacteria、Actinobacteriota、Firmicutes和Acidobacteriota为主要细菌门，Ascomycota、Mortierellomycota和Basidiomycota为主要真菌门；RSD处理提高Ascomycota相对丰度，降低Mortierellomycota、Basidiomycota、Acidobacteriota、Verrucomicrobiota和Chloroflexi，AL的Proteobacteria和Firmicutes高于PE。属水平上，AL和PE提高Bacillus、Paenibacillus和Actinomadura相对丰度，降低Gaiella、Pseudolabrys和Bradyrhizobium；真菌Coniochaeta升高，Fusarium和Mortierella降低，AL的Trichoderma升高，PE的Thielavia和Chaetomium升高。LEfSe鉴定各组指示类群；Venn分析显示RSD处理细菌和真菌OTU数减少，处理间共享3246个细菌OTU和282个真菌OTU。FEAST分析显示AL-RSD处理植物根际细菌和真菌OTU中病土来源比例最低。βNTI和RCBray零模型分析表明异质选择是塑造细菌群落的主要确定性力量，RSD处理细菌βNTI显著下降；真菌组装在各处理间主要为随机过程，漂变是主要机制（|βNTI|<2，RCBray<0.95），RSD增加随机组装过程的相对重要性。由此得出RSD重塑微生物群落组成并改变组装过程。
3.4 共现网络分析：AL和PE改变细菌和真菌共现网络模式；两种RSD处理均降低细菌网络节点和边数，AL降幅大于PE；真菌网络节点和边数同样降低，PE网络复杂性下降更明显，PE提高真菌网络模块化，AL增强连接密度；Zi-Pi图分析表明Candidatus Solibacter、Candidatus Udaeobacter和Nocardioides为细菌群落关键类群，Archaeorhizomyces、Pseudogymnoascus和Neonectria为真菌群落关键类群。由此得出RSD降低网络复杂性但改变网络模块化和关键类群。
3.5 土壤微生物群落潜在功能预测：FAPROTAX和FUNGuild预测表明RSD处理对细菌功能类群影响较真菌更明显；真菌营养型包括病理营养型、共生营养型和腐生营养型，在各RSD处理间差异显著。与CK相比，AL预测增强发酵、延胡索酸呼吸和亚硝酸盐氨化等细菌功能及Undefined Saprotroph真菌类群，降低厌氧光能自养、甲烷氧化、反硝化和铁呼吸等细菌功能及Plant Pathogen真菌类群；PE预测增强甲醇氧化、硫酸盐呼吸和硫化合物呼吸等细菌功能及Dung Saprotroph真菌类群，降低亚硝酸盐呼吸、反硝化和厌氧光能自养等细菌功能及Plant Pathogen真菌类群；与AL相比，PE更显著提高细菌光能异养和真菌Dung Saprotroph，显著降低细菌延胡索酸呼吸、亚硝酸盐氨化、亚硝酸盐呼吸和发酵及真菌Undefined Saprotroph。研究人员指出这些结果为基于分类学的功能推断而非微生物代谢活性或基因表达的直接测定。由此得出不同底物选择性影响土壤微生物功能类群。
3.6 移栽人参生长状况：RSD处理人参生长发育显著改善，块根膨大增强、根部病斑减少；与CK相比，RSD处理显著增加人参根长、根径和鲜重，PE纤维根数显著高于CK；CK发病率为100%、病情指数6，AL发病率为70%、病情指数4.4，PE发病率为20%、病情指数1.4；PE的Re、Rb1、Rb2和Rd含量显著高于CK和AL，但两种RSD处理均显著降低Rg1含量（AL降低约35.3%，PE降低约31.9%），表明处理对人参皂苷积累的影响具有化合物特异性。由此得出PE-RSD显著促进人参生长并降低病害。
3.7 土壤理化性质、酶活性、微生物组、功能与植物生长的关系：相关分析显示Bacillus、Microvirga、Actinomadura、Sphingomonas和Azotobacter相对丰度与EC、OM、发酵和暗氢氧化正相关，与AP、URE活性、甲烷氧化和铁呼吸负相关；Candidatus Udaeobacter、Gaiella、Pseudolabrys、Bradyrhizobium等与AP、URE活性、光能异养、烃降解、甲烷氧化和铁呼吸正相关，与OM、发酵和暗氢氧化负相关；Gemmatimonas和Ramlibacter与EC、AN、几丁质分解和甲醇氧化正相关，与PHO、SUC活性和反硝化负相关。真菌中Mortierella、Trichocladium等与AP、URE活性及多种腐生和病原功能 guild 正相关，与AN、ACP和CAT负相关；Fusarium相对丰度与PHO和SUC活性、动物病原和丛枝菌根功能 guild 显著正相关，与EC和AN负相关；Thielavia、Zopfiella、Chaetomium和Coprinellus与EC、AK、CAT活性和dung saprotroph正相关。VPA表明土壤性质和酶活性共同解释细菌45.13%、真菌82.05%的群落变异，土壤性质贡献大于酶活性，二者交互解释细菌45.9%、真菌52.34%的总变异。PLS-PM显示改善的土壤理化条件与植物生长正相关，AL和PE通过改善土壤理化性质（尤其提高硝态氮和有效钾）显著影响植物发育，并通过介导细菌群落组成和预测功能谱间接影响植物生长；PE对植物生长的直接和总体影响最显著（标准化效应量1.421）。由此得出土壤理化性质是微生物群落动态的核心驱动因子并间接影响人参生长。

讨论部分总结：研究人员指出RSD在人参栽培中具有实际应用前景，显著提高人参生长指标和土壤养分水平，降低病害发生率和严重度。RSD处理显著改变土壤特性：PE可能有助于缓解土壤酸化，但两种底物RSD均未改善土壤盐渍化（EC升高）；两种RSD均提高OM，仅PE-RSD显著提高AN和AK，但PE的SQI与CK无显著差异，故应解释为特定养分性质的选择性改善而非整体土壤质量提升；紫苏较高的钾含量可能在分解中释放钾而贡献AK升高。除CAT外RSD后酶活性均低于未处理土壤，可能与RSD过程影响物质循环和能量代谢、淹水缺氧环境抑制硝化过程导致铵积累并抑制产脲酶微生物、强厌氧环境抑制微生物活性等有关。SQI结果表明PE处理最大限度维持土壤质量，为复种提供更有利环境，其优势可能归因于养分有效性改善、病原菌抑制和底物特异性调控微生物群落的共同作用。移栽试验表明RSD显著改善人参根系生长和鲜重，PE效果尤佳；PE的Re、Rb1、Rb2和Rd含量显著高于CK和AL，但Rg1降低约31.9%–35.3%，表明RSD对人参皂苷积累的影响具有化合物特异性。RSD降低微生物多样性和丰富度，可能与RSD建立的厌氧条件对好氧微生物的不利影响有关，AL对微生物多样性和丰度的影响强于PE；LEfSe显示各处理存在不同生物标志物，底物选择是影响RSD效果的关键因素。RSD重塑微生物群落：Acidobacteriota相对丰度降低，Firmicutes升高（其成员通常耐受严苛条件）；Ascomycota升高，Mortierellomycota降低。Fusarium在两种底物RSD处理中相对丰度显著降低，PE-RSD下降幅更大可能与紫苏中已报道的抗真菌化合物如perillaldehyde有关，PE-RSD显著提高AK也可能与Fusarium发生或活性降低有关，但仅为假设。RSD降低连作土壤来源微生物的贡献，细菌群落由确定性向随机性组装转变，真菌群落几乎完全由随机过程驱动、漂变为主；网络拓扑分析表明RSD降低微生物群落网络复杂性但保留增强网络紧凑性和微生物互作的潜力。VPA和PLS-PM表明土壤理化性质和酶活性是微生物群落动态的核心驱动因子，RSD降低微生物多样性但未损害整体微生物代谢潜力或生态功能，可能归因于有机改良建立的微生物群落功能稳定性和生态韧性增强，关键类群占据关键生态位调控核心酶编码基因以维持必要土壤生态功能；PE相关有效养分增加伴随潜在有益Bacillaceae和Chaetomiaceae富集，这些类群可能通过生态位竞争和抗真菌代谢物产生抑制Fusarium。PE在土壤质量、病原菌抑制和植物生长参数上的持续优势可能源于协调的理化和微生物效应而非单一因素，但基于关联的结果需进一步功能验证。

研究结论翻译：本研究评估了以AL和PE为底物的RSD处理对人参土壤的影响。RSD通过提高OM、AN和AK含量改善土壤养分状况，但降低酶活性。RSD重塑土壤微生物群并降低Fusarium等潜在真菌病原菌。这些效应依赖底物，各处理具有不同的指示类群。在各处理中，PE-RSD显著促进人参生长活力并降低病害发生率和病情指数，表明其作为改善连作人参土壤健康有效策略的潜力，进一步证实了RSD对人参栽培土壤质量的影响。当前研究主要关注RSD处理后一年生长周期内人参的发育模式，在评估长期效应方面存在时间局限性；测序结果描述的是种植前土壤微生物群落，无法确定这些微生物变化在移栽后是否持续。未来研究将实施连续三年田间验证试验并结合移栽前后纵向土壤和根际采样，评估RSD相关微生物变化的稳定性、时间动态及在人参连作体系中的可持续应用潜力。病害调查可能未完全捕捉田间病害发生的小尺度空间变异，未来田间研究将评估每小区更多植株并采用更广泛的空间采样设计以提高病害评估代表性。另一局限是RSD处理期间未连续监测土壤氧化还原电位（Eh），虽土壤维持在水饱和和覆膜条件下，但还原条件的强度和持续时间无法直接验证，未来将在RSD期间纳入连续Eh监测。本研究未包括仅淹水和覆膜而不加有机底物的处理，也未包括不加完整RSD过程的有机底物改良处理，因此无法完全区分有机底物混入效应与综合RSD过程效应，需进一步研究阐明各因素贡献。方法学局限是扩增子测序数据使用QIIME 1.9.1以97% OTU聚类处理而非当前基于去噪的ASV流程，虽支持本研究的群落水平比较但序列分辨率低于现代ASV流程。此外，RSD处理虽显著提高土壤质量和植物表现，但同时降低酶活性并削弱微生物群落网络复杂性，表明微生物互作动态改变；为实现人参栽培最佳土壤改良，RSD应与轮作或针对性养分补充等互补农艺措施策略性整合，以平衡生态功能和农业生产力。