《PLOS Genetics》：Whole-proteome structure/function prediction in uropathogenic E. coli reveals previously missed host-microbe and microbe-phage interaction pathways
编辑推荐：
高通量测序技术的快速发展大幅增加了已知蛋白质序列的数量，但其结构与功能的实验表征仍相对滞后。该知识缺口阻碍了对这些蛋白质生物学机制的理解，限制了高通量实验的解读，并凸显现代生物学中的一项重大挑战：根据蛋白质序列推断其结构与功能信息。多数计算方法依赖与注释良好蛋
高通量测序技术的快速发展大幅增加了已知蛋白质序列的数量，但其结构与功能的实验表征仍相对滞后。该知识缺口阻碍了对这些蛋白质生物学机制的理解，限制了高通量实验的解读，并凸显现代生物学中的一项重大挑战：根据蛋白质序列推断其结构与功能信息。多数计算方法依赖与注释良好蛋白质的同源性，但许多蛋白质缺乏可识别的同源物，降低了该方法的效力。在此，研究人员整合前沿的蛋白质结构与功能预测方法，开发了完整的序列-结构-功能流程，可基于一级序列预测结构与功能。研究人员将该流程应用于尿路致病性大肠杆菌（uropathogenic E. coli, UPEC）模式菌株Escherichia coli UTI89全部蛋白质的结构与功能预测。基于预测功能，研究人员对全基因组进行富集分析，揭示了该菌中注释不足蛋白质的可能作用及相关生物学机制。此外，通过UTI89_C0931和ybtS基因的详细案例研究，进一步验证了该流程的性能。最后，研究人员构建了UTI89结构与功能数据库（https://seq2fun.dcmb.med.umich.edu/UTI89），将其作为重要资源，帮助研究人员阐明未注释蛋白质的作用。该数据库旨在弥合微生物致病性与耐药性方面的关键知识缺口，增强应对新发健康威胁的能力。
研究背景与问题：高通量测序使蛋白质序列数量迅速增长，但实验表征与人工注释明显滞后；截至2024年11月，TrEMBL已超过2.53亿条目，而Swiss-Prot中可靠注释不足已知序列的0.5%。即使对研究充分的Escherichia coli K12 MG1655，仍有超过30%基因未表征或注释不足；低注释蛋白可具有重要适应效应。尿路致病性大肠杆菌（uropathogenic E. coli, UPEC）是尿路感染（urinary tract infection, UTI）的主要病原体，约占无并发症UTI的75%和复杂性UTI的50%以上，全球每年估计超过4亿例和25万例死亡，且耐药性上升，亟需发现新抗菌靶点和疫苗靶点。UTI89为UPEC模式菌株（ST95，最初分离自急性膀胱感染患者），其5,192个蛋白中超过88%（4,549个）在UniProt中注释不足，质粒编码蛋白约99.3%为低注释。因此，研究人员开展全蛋白组结构/功能预测，以补充现有注释并解析低注释蛋白的潜在生物学角色。
关键技术与方法：研究人员构建自动化序列-结构-功能流程，分为序列到结构和结构到功能两个模块。序列到结构模块用DIAMOND从蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）和AlphaFold数据库（AlphaFold Database, AFDB）鉴定模板，并按序列同一性、平均预测局部距离差异检验（predicted local distance difference test, pLDDT）等条件直接采用PDB结构、LOMETS3、MODELLER，其余序列用D-I-TASSER（<900个氨基酸）或DMFold（>900个氨基酸）建模；结构到功能模块用StarFunc预测功能，置信分数（Cscore）>0.5视为可信预测。富集分析采用卡方检验、Benjamini-Hochberg FDR校正和log odds-ratio；性能评估使用Dataset I（250个新注释蛋白）和Dataset II（128个蛋白的AlphaFold2不同pLDDT模型），以信息增量加权F值（information accretion-weighted F-measure, wFmax）评价。UTI89蛋白序列来自UniProt UP000001952，GO注释来自UniProt-GOA 2024-07-02；Ybt验证使用UTI89?ybtS及稳定同位素稀释质谱。
研究结果：（1）功能注释的一般统计分析。研究人员比较UniProt注释与流程预测，发现K12同源转移后仍有48.9%（2,541个）蛋白低注释；在K12更新后，StarFunc新增31,512个GO注释，其中分子功能（molecular function, MF）5,132个、生物学过程（biological process, BP）11,584个、细胞组分（cellular component, CC）14,796个；摘要报告MF、CC、BP分别增加15.0%、64.1%、31.1%。预测补充了脂多糖生物合成、共生体介导宿主内膜系统扰动、甘露糖PTS转运体活性等功能；85个蛋白被独特注释为病毒生命周期，其中65个（76.5%）被PHASTER识别为噬菌体相关基因。（2）基于结构的功能预测提高功能注释覆盖度。在250个测试蛋白上，流程平均wFmax为0.535，分别比基于序列的方法（0.511）、DeepGOPlus（0.505）、NetGO 3.0（0.464）和GOAnnotator（0.388）高4.7%、5.9%、15.4%和37.8%；注释分数为1的蛋白中，BP、CC、MF至少获得一个特定GO注释的比例分别为54.0%、97.9%、41.7%，较UniProt分别高35.8%、75.0%、16.4%。HybC被补充“厌氧呼吸/GO:0009061”和“呼吸电子传递链/GO:0022904”。（3）分层流程为难预测蛋白质结构靶标提供更高置信度模型。Dataset II显示较高pLDDT模型提高MF和CC预测，BP对pLDDT不敏感；714个蛋白缺乏高质量模板，其中696个用D-I-TASSER、18个用DMFold建模。D-I-TASSER模型的平均和中间pLDDT为62.47和64.00，较AFDB的53.92和56.01提高15.9%和14.3%，89.4%（622/696）蛋白pLDDT更高；13个无AFDB结构蛋白的DMFold模型平均pLDDT为82.79。（4）未表征蛋白质中富集的功能。log odds-ratio分析显示，低注释蛋白在BP中富集病毒过程、病毒生命周期、病毒粒子组装、宿主细胞退出、病毒释放、共生体介导宿主细胞内膜系统扰动、与宿主互作、种间互作、细胞黏附和细胞对铁离子响应；在CC中富集病毒粒子组分、病毒衣壳、病毒尾部、宿主细胞、宿主细胞部分、胞外区、菌毛、内膜系统和细胞突起；MF无系统性富集而有耗竭。与定植和毒力相关的BP GO术语富集中，细胞黏附新增8个蛋白（7个低注释），细胞对铁离子响应新增8个蛋白（均低注释）。与定植和毒力相关的CC GO术语富集中，病毒粒子组分、病毒尾部、病毒衣壳在UniProt中无UTI89蛋白注释，而流程分别预测51、32、8个；菌毛新增1个、细胞突起新增17个；96个生物膜相关基因中36个低注释蛋白均获高置信GO注释，50个胞内细菌群落（intracellular bacterial communities, IBCs）差异表达基因中35个低注释，其中34个获注释。（5）使用序列-结构-功能衍生功能注释的案例研究。案例1：UTI89_C0931（Q1RDZ8）可能为噬菌体裂解蛋白。该蛋白在UniProt中仅注为DUF2570结构域蛋白和膜/GO:0016020；StarFunc高置信预测“杀灭其他生物细胞/GO:0031640”和“共生体介导宿主细胞溶解/GO:0001897”；D-I-TASSER结构呈四个α-螺旋区，StoPred与AlphaFold3提示四聚体最可能（ipTM=0.29），呈杆状卷曲螺旋，类似λ噬菌体Rz spanin系统，且其操纵子含endolysin、holin、尾部及头部完成/稳定蛋白。案例2：ybtS（Q1RAG5）是参与铁载体生物合成的关键毒力因子。该蛋白与5JY9链A（Yersinia enterocloitica水杨酸合酶）序列同一性>99%，用LOMETS3建模；UniProt指向邻氨基苯甲酸合酶活性和L-色氨酸生物合成，StarFunc则指向铁载体生物合成和铁稳态；ybtS位于高致病性岛，编码分支酸转化为水杨酸的第一步；2-羟基苯甲酸可恢复UTI89?ybtS的耶尔森菌素（yersiniabactin, Ybt）产生，氘代水杨酸标记实验产生m/z 539峰，支持外源水杨酸直接用于Ybt合成。（6）E. coli UTI89结构-功能数据库。研究人员将全部5,192个蛋白的结构与功能预测汇总为可检索数据库，主页列UniProt ID、蛋白名、基因名、蛋白大小、注释分数、结构预测方法和GO编号；个体页展示Foldseek/TM-align结构类似物、BLASTp同源物和StarFunc预测结果。
讨论与结论翻译：研究人员报道了一种自动化、基于结构的蛋白质功能注释流程的开发及初步应用，以应对人工和实验注释难以匹配已知蛋白空间快速扩张的问题。该研究对E. coli UTI89全部5,192个蛋白进行结构与功能预测，并建立UTI89结构-功能数据库；据研究人员所知，这是首个提供基于全蛋白组结构建模的系统功能注释在线资源。对缺乏PDB或AFDB高质量模板/模型的蛋白，研究人员采用DMFold和D-I-TASSER生成新模型；在696个需从头建模的困难蛋白中，89%的pLDDT较AFDB改善，13个无UniProt结构信息蛋白获得平均pLDDT为82.79的DMFold预测结构。该流程可提供比UniProt更详细、特异的注释，并与UniProt GO注释互补，整合后可提高UTI89蛋白组注释覆盖度。富集分析显示，许多低注释蛋白参与微生物致病与宿主互作相关过程，包括黏附、侵袭及铁等限制性营养获取，提示这些未表征蛋白的生物学相关性及发现新生物标志物和治疗靶点的潜力。两个案例UTI89_C0931和ybtS均得到已有文献和本研究报告实验的支持。研究人员预计该数据库将成为重要资源，并提供开源工具以便推广至其他生物。同时，不能假定数据库预测无误，尤其用于后续实验设计时需综合全部可用信息；该流程需频繁更新以采用各子任务最强工具，且尚未自动化修剪高丰度或基于分类学分析可能错误的GO术语，这些是未来扩展方向。
