《PLOS Global Public Health》：Interlaboratory comparison of a multiplex bead assay against the Chlamydia trachomatis antigen Pgp3 using two monoclonal antibody clones
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沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）可引起三种不同的疾病——泌尿生殖道沙眼衣原体感染、眼部疾病沙眼（trachoma）以及性病淋巴肉芽肿（lymphogranuloma venereum, LGV）。在过去十年中，利用血清学检测评估沙眼衣原
沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）可引起三种不同的疾病——泌尿生殖道沙眼衣原体感染、眼部疾病沙眼（trachoma）以及性病淋巴肉芽肿（lymphogranuloma venereum, LGV）。在过去十年中，利用血清学检测评估沙眼衣原体暴露情况以评价眼部疾病危险因素和开展基于人群的监测的应用不断扩大。研究人员开发了针对沙眼衣原体抗原Pgp3的嵌合单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb），作为Pgp3血清学检测的标准化试剂。本研究使用两种抗Pgp3单克隆抗体（1G1和1C3），在4个不同实验室（各采用自有操作方案）、由5名操作人员使用3种不同仪器类型，对基于Luminex的Pgp3多重微珠血清学检测（multiplex bead assay, MBA）进行实验室间比较。滴加于滤纸上的抗体在室温下可稳定保存两周。在每种单克隆抗体的3个浓度（高、中、低）下评估准确度和精密度。1G1在11/21种条件下、1C3在18/21种条件下准确度处于20%以内；高浓度条件下准确度最差。所有低浓度和中浓度条件的精密度均在10%以内，高浓度下若干条件的精密度超过10%。不同仪器间荧光值存在差异，但利用标准曲线外推至浓度后未见差异。上述数据提示1C3可能是更可靠的标准试剂，且Pgp3多重微珠检测在比较不同仪器和检测方案时具有高度稳健性。
研究背景方面，沙眼衣原体根据感染途径和感染血清型可导致不同临床疾病：血清型A-C引起沙眼，反复结膜感染可导致上睑结膜瘢痕形成及上睑弹性丧失进而致盲；血清型D-K经性传播引起泌尿生殖道沙眼衣原体感染，在女性中可进展为盆腔炎性疾病、不孕症和异位妊娠；血清型L1-L3主要与泌尿生殖道或肛门直肠感染相关的性病淋巴肉芽肿有关。感染诊断采用核酸扩增检测，而血清学越来越多地用于监测或识别进展性疾病的危险因素。目前大多数沙眼衣原体血清学检测靶向抗原Pgp3，已开发出基于Pgp3的多重微珠免疫检测、酶联免疫吸附检测（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）和快速侧向流检测（lateral flow assay, LFA）。多项研究评估了Pgp3血清学与输卵管因素不孕和盆腔炎性疾病风险、卵巢癌及流产之间的关联。Pgp3血清学也被用于估计人群水平的沙眼衣原体暴露情况。国家沙眼项目越来越多地采用血清学监测以了解持续性和复发性沙眼地区的眼部沙眼衣原体暴露情况，并将其作为验证后监测的潜在工具。本研究中所用的Pgp3-MBA和Pgp3-LFA方法专门为沙眼项目开发，其中Pgp3-LFA提供低技术、低成本的选择，Pgp3-MBA则提供用于整合血清学调查的选择。鼠-人嵌合单克隆抗体的制备使得检测性能得以全面验证，两种独立克隆（1G1和1C3）表明两种检测的检出限（limit of detection, LOD）均为75 ng/mL。克隆在-20°C和4°C下储存长达2年保持稳定，但运输试剂时可能遇到的较高温度尚未评估。LFA为定性检测且方案标准化，而MBA为半定量检测，开展整合血清学监测的实验室各自独立开发检测方法，方法和仪器各不相同。因此，研究人员开展了Pgp3-MBA的实验室间稳健性评估，使用两种Pgp3单克隆抗体克隆在4个实验室、3种仪器类型和多种检测方案下进行测试。
在技术方法上，研究人员首先将Pgp3单克隆抗体克隆1G1和1C3稀释于正常人血清（normal human serum, NHS）中制备浓度梯度，滴加于TropBio滤纸延伸物上，经室温干燥后密封保存，用于稳定性测试（设置室温及37°C条件下3、7、21天的时间点，以-20°C基线样本对照，通过多重微珠检测在Bio-Plex 200仪器上读取中位荧光强度并扣除背景（MFI-bg））。实验室间比较中，制备12点标准曲线（8–16,000 ng/mL），并制备高（6000 ng/mL）、中（1200 ng/mL）、低（200 ng/mL）三个浓度的未知样本，滴加于滤纸后运输至4个实验室，由5名操作人员使用3种仪器（Bio-Plex 200、MAGPIX、Intelliflex）在3–5个不同天数内按各实验室自有方案检测。数据分析采用GraphPad Prism 9进行五参数 logistic 曲线拟合计算浓度，以计算浓度/实际浓度×100评估准确度（目标范围80–120%），以变异系数（coefficient of variation, %CV）评估实验室内和实验室间精密度，并采用分层Wilcoxon-Mann-Whitney检验（Van Elteren检验）和McNemar检验进行统计学比较。
研究结果方面，在稳定性方面，通过比较基线与各时间点各温度下MFI-bg的决定系数和斜率得出：克隆1G1在所有时间点和温度下R2值均大于0.997，但斜率随时间下降，37°C第21天斜率最低为0.508；克隆1C3的R2值范围为0.974–0.999，除37°C第21天斜率降至0.718外，其余时间点斜率均保持在0.902以上。在实验室间比较方面，通过各实验室对未知样本的浓度计算得出：克隆1C3的中、低浓度未知样本在所有实验室准确度均处于80–120%目标范围内，1C3超出范围的结果少于1G1（3/21 vs 10/21，p = 0.039），1C3的绝对误差也低于1G1（p = 0.038），两种指标的差异主要由最低浓度结果驱动。在精密度方面，通过实验室内和实验室间变异系数评估得出：两种克隆在所有实验室的中、低浓度样本实验室内精密度％CV均低于10；实验室间精密度中，低、中浓度样本％CV低于15，但高浓度样本两种克隆均超过20；实验室水平平均浓度比较显示1C3偏离组均值小于1G1（p = 0.022）。
讨论部分总结：研究结果表明Pgp3-MBA在不同实验室采用的各种条件和检测组合下具有稳健性。不同仪器类型和方案产生不同的原始MFI读数，但利用Pgp3单克隆抗体标准曲线外推的数据在实验室间显示高精密度，提示Pgp3单克隆抗体可用于在不同MBA方案和仪器的实验室间标准化Pgp3抗体结果；或者，基于各仪器和方案确定的临界值对未校正数据进行阳性/阴性分类也应产生可重复的数据。本研究还评估了两种克隆在运输至多个大陆实验室后的真实世界性能：克隆1C3在室温下稳定21天，而克隆1G1在室温下3天后信号开始下降，提示1C3在运输时间少于21天时无需冷藏，可能比1G1更适合转移至不同实验室。克隆1C3在更多检测情境下（18/21）准确度处于80–120%目标范围内，优于1G1（11/21）；1C3的3个超出范围的读数均为高浓度阳性未知样本，这对沙眼项目或一般人群调查不应构成问题，因为结果通常按阳性/阴性判读，接近临界值时获得准确值更为关键。此外，所选取的可接受范围源自国际人用药品技术要求协调理事会的药物分析准确度接受标准，可能比血清学检测更为严格。除1G1高浓度阳性样本的实验室间CV外，两种克隆的％CV均在范围内。数据表明1C3比1G1产生更准确和可重复的结果。研究局限性包括：仅评估了一个批次的Pgp3单克隆抗体，需要测试更多批次以确保不同实验室间批次性能一致；所用基于Luminex的仪器针对多病原体检测优化，需要在额外抗原背景下以单重与多重方法比较评估性能；虽使用标准曲线在实验室间进行归一化，但这些检测在操作上并非定量，所展示数据不一定反映正常的机器输出。未来可研究利用单克隆抗体在不同仪器和检测中生成定量限并比较共同标本集的患病率数据。此类单克隆抗体具有多种应用：首先，血清学检测的验证因缺乏标准化试剂和对照而困难，使用单克隆抗体可评估检测在整个范围内的性能并确定准确度和线性；其次，该试剂可用于评估新检测、向新实验室转移技术以及培训和能力测试；该试剂还可用于开发能力验证面板，借助标准化浓度确保不同实验室间的检测性能。所描述的方法可推广至不断发展的多病原体血清学监测领域，其中Pgp3单克隆抗体等合格试剂对于多站点检测标准化至关重要。研究结论翻译：上述数据提示1C3可能是更可靠的标准试剂，且Pgp3多重微珠检测在比较不同仪器和检测方案时具有高度稳健性。
