《PLOS Global Public Health》：Identifying subgroups with decreased performance on malaria rapid diagnostic tests in Malawi
编辑推荐：
研究人员旨在识别床旁疟疾快速诊断试验（MRDTs）性能下降的人群亚组，以提高基于MRDT诊断的准确性。研究人员基于2019年至2021年马拉维农村卫生中心的1108次患者就诊，评估了恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）MRDTs与定量聚合酶
研究人员旨在识别床旁疟疾快速诊断试验（MRDTs）性能下降的人群亚组，以提高基于MRDT诊断的准确性。研究人员基于2019年至2021年马拉维农村卫生中心的1108次患者就诊，评估了恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）MRDTs与定量聚合酶链反应（PCR）相比在各人群亚组中的性能。约48%的疟疾PCR和37%的MRDT为阳性。总体而言，PCR阳性参与者中MRDT阳性的比例（灵敏度）为67%，PCR阴性参与者中MRDT阴性的比例（特异度）为91%。灵敏度随年龄变化，25–40岁受试者最低（38%），<1岁受试者次低（33%），5–8岁受试者最高（86%）。几乎所有MRDT阴性/PCR阳性不一致病例（假阴性MRDT）的寄生虫密度<200个/μl血液。在回归模型中，男性、较年轻年龄以及发热、头痛、寒战和呕吐的存在降低了假阴性结果的可能性。发热、头痛、寒战和呕吐的存在更可能导致假阳性结果。使用分类树分析，临床和人口学特征的组合预测真阳性和真阴性MRDT结果的总体准确率分别为79%和84%。年龄与寄生虫密度呈负相关；年龄而非寄生虫密度被纳入回归模型和分类树，因为年龄是临床医生可轻易获得的信息。尽管PCR与MRDT之间的不一致有多种可能解释（包括偶然性疟疾感染），MRDTs在某些亚组中表现较差，这可能为这些重要工具在临床环境和疟疾监测中的部署与开发提供参考。
**研究背景**
疟疾是全球健康影响最大的寄生虫病，据估计2024年有2.82亿病例并导致超过60万人死亡，其中主要为5岁以下儿童。世界卫生组织（WHO）推荐的控制疟疾负担的主要策略之一是对所有疑似病例进行快速诊断和治疗，该策略的有效性依赖于准确诊断。恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）疟疾快速诊断试验（MRDTs）是经济有效的工具，可将检测扩展到通常无法进行熟练显微镜检查的床旁场景。最常见的MRDTs基于富组氨酸蛋白2（HRP2）检测，其他检测疟原虫乳酸脱氢酶（pLDH）或醛缩酶。WHO标准要求MRDTs应能检测到低至200个寄生虫/μL血液的诊断阈值，而显微镜检查的检测下限约为100个寄生虫/μL。2011年一项关于MRDTs在无并发症疟疾中与显微镜检查相比的真实世界性能的系统综述显示，基于HRP2的MRDTs平均灵敏度和特异度均为95%，但灵敏度在各研究间从42%到100%不等，特异度从65%到100%不等；基于pLDH的检测灵敏度略低但平均特异度更高。近期数据提示更为复杂的图景。多项研究中MRDT灵敏度和特异度随年龄和寄生虫密度显著变化。灵敏度似乎随患者年龄增长而下降，可能由于反复暴露和免疫力增强导致寄生虫密度降低。与PCR相比，在莫桑比克的一项研究中，传统HRP2-based MRDTs在寄生虫密度低于100/μL时仅检测到约50%的感染，在1,000至10,000/μL之间仅检测到约70%的感染。在埃塞俄比亚的一项研究中，基于pLDH的MRDTs与PCR相比灵敏度为69%。HRP2缺失的出现可能部分解释某些地区灵敏度下降。尽管该缺失的流行率存在显著异质性，但近期在马拉维北部和中部报告了显著发生率。此外，MRDT漏检的病例可能代表亚临床疟疾感染，其症状可归因于其他原因而非疟疾。特异度下降可能部分由HRP2清除缓慢解释，成功抗疟治疗后HRP2可持续数周，但该现象对假阳性病例的贡献程度尚不清楚。在上述埃塞俄比亚研究中，基于pLDH的MRDTs与PCR相比特异度为38%。在坦桑尼亚的一项研究中，5–9岁幼儿的特异度低至25%。尽管MRDTs对疟疾病例管理仍不可或缺，但在不同疟疾流行环境中识别MRDT性能降低的亚组及其相关寄生虫密度和感染史非常重要。由于MRDTs可能漏检感染，将MRDTs与可通过床旁实施的算法获得的临床特征相结合可帮助提高准确性并区分临床性与亚临床或偶然性疟疾感染。近期研究人员已使用机器学习利用临床和人口学特征开发疟疾诊断预测模型，但这些特征在低强度和高强度传播区之间存在差异。本研究通过比较定量PCR与MRDT结果的寄生虫存在情况，旨在识别MRDT性能下降的人群亚组以及在中等强度传播区提高基于MRDT诊断准确性的方法。
**主要关键技术方法**
研究人员在马拉维南部两个农村卫生中心（Ntaja，Machinga区；Namanolo，Balaka区）的集水区开展了基于社区的队列研究，招募时间为2019年4月2日至2020年3月20日，被动病例检测（PCD）访视持续至2021年10月7日。研究纳入468名参与者来自174户家庭的1108次PCD访视。在PCD访视时进行MRDT检测并采集干血样，采用甲醇法提取DNA，使用qPCR检测并定量恶性疟原虫18S核糖体RNA基因。统计分析采用Wilcoxon检验、卡方或Fisher精确检验比较组间差异；使用逻辑广义可加混合模型（含随机截距）评估假阳性/假阴性结果的预测因素；使用分类树模型探索真阳性和真阴性MRDT结果的预测因子组合。所有分析使用R软件版本4.4.1完成。
**研究结果**
**假阳性和假阴性MRDT结果高风险亚组的识别**
寄生虫密度对MRDT性能表现出最强影响。假阴性MRDT结果主要发生在寄生虫密度低于100个寄生虫/μL的参与者中。仅11例（6%）假阴性结果的寄生虫密度高于200个寄生虫/μL的标准MRDT诊断阈值，均见于3–18岁参与者（中位年龄11岁，IQR 9–14），中位寄生虫密度为2,146个/μl（IQR 1,192–11,501）。高密度假阴性结果更可能发生在旱季，而整体假阴性在研究期间更常见于雨季。所有高密度假阴性结果均发生在一个研究点，且多数（8/11）发生在2021年即研究期接近结束时。
MRDT灵敏度（67%）随PCD访视时年龄显著变化，在5–8岁（86%）和8–12岁（83%）达峰，在年龄两端较低。5岁以下儿童灵敏度较低（63%），但特异度高达93%。值得注意的是，1岁以下婴儿灵敏度尤其差（2例假阴性/3例阳性；灵敏度33%），尽管该年龄组仅7次访视。18岁后灵敏度下降（18–25岁为50%，25–40岁为38%）。PPV与灵敏度在年龄相关性能方面相关。特异度总体较高为91%，随年龄变化较小。
粗回归分析中也存在假阴性MRDT比例的年龄趋势：最年幼参与者假阴性结果概率较高，随年龄增长至约8岁下降，之后开始上升。调整人口学和临床变量后，较年轻参与者假阴性结果比值比较低，且与年龄的关联近似线性。此外，女性参与者以及有发热、寒战、头痛和呕吐的参与者假阴性结果比值比降低。粗分析中生命最初几年假阴性预测概率的急剧下降在调整模型中未见，因为最年幼参与者报告寒战、头痛和呕吐的概率极低，而这些因素与较低假阴性概率相关。访视时年龄与对数转换寄生虫密度呈负相关，与观察到的寄生虫密度随年龄增加而下降一致。研究人员选择将年龄纳入最终模型，因为年龄不同于寄生虫密度，是临床医生在床旁可获得的临床变量。此外，赤池信息准则（AIC）提示含年龄的模型拟合（2563.3）优于含寄生虫密度的模型（3325.7）。值得注意的是，含年龄和寄生虫密度模型中临床特征的关联具有可比性。
年龄不是假阳性结果的统计学显著预测因子。在PCR阴性者中，有发热、寒战、头痛和呕吐的参与者在调整模型中假阳性MRDT结果比值比增加。值得注意的是，无假阳性结果参与者在30天内有先前MRDT阳性的PCD访视。仅2例假阳性MRDT结果参与者报告在PCD访视前因本次疾病寻求过治疗；两者均报告先前使用过抗疟药物。
**预测真阳性和真阴性MRDT结果的算法**
PCR阳性子集的分类树基于多种临床和人口学因素进行分割，包括年龄和症状。例如，有发热、年龄小于18岁、无头痛但有寒战的参与者被预测为真阳性结果。该树检测真阳性MRDT结果的灵敏度为80%，特异度为77%，总体准确率为79%。
PCR阴性子集的分类树包括许多与PCR阳性子集相同的临床和人口学特征，以及访视是否发生在雨季和参与者是否居住在完工房屋中。该分类树检测真阴性MRDT结果的灵敏度为85%，特异度为80%，总体准确率为84%。
使用这些分类树算法时，临床医生应考虑当地疟疾流行率。在本研究中，卫生中心访视的疟疾检测阳性率（流行率的替代指标）为48%，树的PPV为77%（PCR阳性树），NPV为85%（PCR阴性树）。这些预测值将随流行率升高或降低而变化。例如，流行率为60%时，PPV增至84%，NPV降至73%。
**讨论部分总结**
总体而言，MRDT的操作特征在先前发表范围内。然而与其他研究一样，MRDT性能存在变异性。通常，经PCR确认但被MRDT漏检的疑似疟疾感染寄生虫密度较低，尽管MRDTs检测到一些低于200个寄生虫/μL阈值的感染并漏检了一些高于该阈值的感染。未来研究需要更好地理解极低密度疟疾寄生虫血症的临床意义。寄生虫密度低于MRDT诊断阈值的患者中MRDT阴性而PCR阳性可由偶然性寄生虫血症和导致症状的替代病因（如病毒感染）解释。确实，无常见疟疾症状（包括发热、寒战、头痛和呕吐）的参与者假阴性结果比值比更高。由于研究地点为农村资源受限的医疗环境，没有其他诊断检测如X线或病毒检测可用。因此，研究人员确定假阴性MRDT病例替代病因的能力有限。或者，一部分MRDT阴性而PCR阳性的结果可能代表寄生虫密度低于MRDT诊断阈值的真实临床疟疾。先前研究提示致热阈值（与发热发作相关的最低寄生虫血症水平）在年幼儿童和低传播率地区降低。一些研究发现幼儿和婴儿的致热阈值低于200个寄生虫/μL。亚微观疟疾感染（经分子技术检测但显微镜检查未检测到的感染）在卢旺达和乌干达儿童研究中与较高发热风险相关。一项较早的马拉维研究发现亚微观感染与雨季发热比值比增加相关，但未达统计学显著性；有趣的是，旱季此类感染与发热比值比统计学显著下降相关。11例高密度假阴性病例均发生在一个研究点且多数在研究期接近结束时，这共同提示HRP2缺失可能促成了MRDT阴性结果。研究时马拉维尚不知存在HRP2缺失，因此未进行HRP2基因分型。一项与本研究同时进行的研究在马拉维中部和北部地区发现该缺失的高发生率（10–15%），但目前似乎没有证据表明本研究所在的南部地区存在高发生率。本研究中低密度假阴性病例远较高密度病例常见，可能指向低寄生虫密度是假阴性MRDT的主要驱动因素。时间和地点聚集也可能指向操作者或设备误差作为 contributing factors，但研究人员无法确定每次遭遇的检测操作者或具体MRDT品牌。与其他研究一样，研究人员发现MRDT性能随年龄高度可变，灵敏度在18岁后急剧下降，且最年长亚组（>25岁）真阳性的中位寄生虫密度低于诊断阈值。同样令人担忧的是，尽管样本量有限，5岁以下儿童假阴性结果高发生率的发现，该人群面临疟疾相关严重发病和死亡的重大风险——该风险并不总是与寄生虫密度良好相关。本研究结果提出了是否应考虑对年龄两端人群以及疟疾传播低水平地区或季节中面临最高低水平寄生虫血症风险（可能被MRDTs漏检）的人群采用更敏感的诊断模式的问题。这对使用MRDTs的国家疟疾监测项目和疟疾流行病学研究尤为如此。假阳性结果（即MRDT阳性而PCR阴性）在有发热、寒战、头痛或呕吐者中更可能。假阳性的 underlying reason 仍无法解释。如上所述，无假阳性结果访视在30天内有先前MRDT阳性的PCD访视，仅2例有先前报告的抗疟药物使用。这些发现可能使大量假阳性结果由先前治疗疟疾感染残留HRP2抗原所致的可能性降低，尽管缺乏详细治疗史信息限制了可得出的结论。假阳性结果可能导致次优患者管理并增加卫生系统负担，包括不必要使用抗疟治疗或不适当停用指示性抗生素治疗。假阳性疟疾感染结果也可能挑战疟疾监测工作。本研究有许多优势，最显著的是涵盖各年龄组的大样本量和延长随访期。也有一些局限性。MRDTs检测寄生虫蛋白而PCR检测寄生虫DNA，两者均不同于检测完整寄生虫的显微镜检查。这可能影响检测模式之间的直接比较。MRDT的靶标（HRP2）与PCR的靶标不同。研究人员未检测可能导致假阴性结果的HRP2缺失。此外，研究期间研究点之间MRDT品牌存在变异，且PCR检测仅专注于恶性疟原虫检测；马拉维近期监测显示寄生虫血症者中三日疟原虫（P. malariae）流行率为10–15%，尤其在无症状病例中。最后，尽管总体样本量可观，但不足以可靠地将数据划分为独立的训练集和验证集用于本文提出的临床诊断算法。未来需要更全面临床表征患者的研究来验证这些发现。诊断和治疗后随访患者可帮助确定MRDT误分类是否影响临床结局。额外研究还可评估在假阳性和假阴性率较高年龄组部署更敏感诊断模式的可行性和成本效益。临床诊断算法可整合到手机应用程序中并支持床旁诊断。这可使疟疾诊断较少依赖寄生虫密度阈值，并为脆弱人群带来更有效的管理。
**研究结论翻译**
尽管PCR与MRDT之间的不一致有多种可能解释（包括偶然性疟疾感染），MRDTs在某些亚组中表现较差，这可能为这些重要工具在临床环境和疟疾监测中的部署与开发提供参考。
