《PLOS Computational Biology》：Folding without glutamine: Proteome-scale removal of a canonical amino acid
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所有已知生命均使用由20种经典氨基酸构成的通用字母表，然而哪些残基在结构上真正不可或缺，此前从未在蛋白质组尺度上被检验。近期研究在大肠杆菌（Escherichia coli）核糖体蛋白中消除了异亮氨酸，证明氨基酸字母表缩减具备可行性。本研究进一步追问：能否从整
所有已知生命均使用由20种经典氨基酸构成的通用字母表，然而哪些残基在结构上真正不可或缺，此前从未在蛋白质组尺度上被检验。近期研究在大肠杆菌（Escherichia coli）核糖体蛋白中消除了异亮氨酸，证明氨基酸字母表缩减具备可行性。本研究进一步追问：能否从整个蛋白质组中彻底移除某一种氨基酸，并建立计算框架以筛选最优目标。研究人员借助两种独立策略——基于结构的ProteinMPNN概率与多序列比对（MSA）保守性——定义“保留评分（keep-score）”为天然残基在该位点最优的比例。两法共同指向一个意外候选：谷氨酰胺保留评分最低，而脯氨酸与甘氨酸最高，这与替换矩阵直觉相悖。谷氨酰胺的低保留评分并非由单一替代者解释，谷氨酸仅在14%替换中被偏好。研究人员将4148个蛋白中全部谷氨酰胺替换为ProteinMPNN最优替代，并用AlphaFold2建模。重编码蛋白质组维持了天然样结构：85.5%模型TMscore超过0.8，与天然重建序列基线85.9%无差异。正交验证（ESMFold预测、Rosetta能量计算、构象集合比较）均未发现谷氨酰胺移除导致系统误折叠的证据。一致性检验中，经ProteinMPNN设计的无谷氨酰胺TEM-1 β-内酰胺酶在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性，表明折叠保持可延伸至生物学功能。进化证据显示24%大肠杆菌蛋白在原核基因组中存在无谷氨酰胺同源物，酵母中谷氨酰胺保留评分亦最低。结果表明：整个氨基酸可从蛋白质组移除且折叠广泛保留，确立keep-score为通用框架、谷氨酰胺为首要重编码靶标。需强调，这反映结构可替换性的计算分析，而非生物学不可或缺性的证明。
研究背景与问题提出
所有已知生命以20种经典氨基酸构建蛋白质，这一通用性延续数十亿年。前期Liu等已在大肠杆菌核糖体蛋白中消除异亮氨酸（Ile），建立19氨基酸生命的实验雏形；但在“删减哪一种氨基酸最容易”这一前提问题上，学界缺乏蛋白质组尺度的系统判断。传统替换矩阵（如PAM、BLOSUM）与简化字母表研究倾向于认为疏水残基（如Ile）最易替代，且谷氨酰胺（Gln）常与谷氨酸合并。然而进化容忍的成对交换不等于结构层面的真正约束。核心问题是：哪一种氨基酸在三维架构中结构必要性最低，可被选为全蛋白质组移除的首选靶标。
研究人员工作与总体结论
研究人员以大肠杆菌为模型，提出“保留评分（keep-score，某残基在位点被判定最优的比例）”与“保留倾向（keep-propensity）”指标，联合结构逆向折叠模型ProteinMPNN与进化多序列比对（MSA）两套独立信号，量化20种氨基酸的可移除性。两法一致显示谷氨酰胺保留评分最低、结构约束最弱；将其全蛋白质组移除后，AlphaFold2预测折叠与天然重建基线无统计学差异，正交方法交叉验证无系统误折叠。单蛋白功能检验（TEM-1 β-内酰胺酶）证实无谷氨酰胺酶仍具催化活性。研究意义在于：给出“先选靶标再重编码”的通用计算框架，证明20氨基酸字母表并非刚性下限，为合成简约基因组与生物封闭策略提供路线。
主要关键技术方法
研究人员使用大肠杆菌K-12完整蛋白质组参考结构（AlphaFoldDB，4148–4363条单链模型）为对象；以LigandMPNN（ProteinMPNN变体）对天然骨架逐位点打分，取10次平均概率表；用MMseqs2从9285个真细菌蛋白质组建非冗余同源库，MUSCLE构建保守MSA；以AlphaFold2对重编码序列建模，TMscore与RMSD比对参考；辅以ESMFold正交预测、Rosetta全原子能量（REU）松弛、FoldMason局部结构比对、BioEmu构象集合抽样；进化证据来自6369个原核完整基因组中互逆最佳同源（reciprocal best hit）统计；功能一致性以TEM-1 β-内酰胺酶氨苄青霉素抗性表型与硝基头孢菌素原位活性为读值。
研究结果
Keep-score筛选最可移除氨基酸
通过ProteinMPNN概率与MSA列保守频率分别计算20种残基keep-score，两轴强相关（Pearson r=0.78）。谷氨酰胺MPNN keep-score仅0.13（87%位点可替），脯氨酸、甘氨酸最高。keep-propensity分布中谷氨酰胺替代阻力最小，且无主导替代者（谷氨酸仅14%），说明其可替性来自位置约束松散而非化学相似。
重编码蛋白质组的结构保真基线
对原生序列重建模得“重建基线”：86%蛋白TMscore>0.8，低分者伴随高预测对齐误差（PAE），属柔性而非误折叠。以此ease-score归一化后续比较。
单氨基酸移除的扰动排序
在300个高ease蛋白中，将20种氨基酸分别MSA共识替换，按RMSD排序：keep-score越低移除扰动越小；谷氨酰胺显著优于11种高keep残基，与其余低keep残基并列最温和。跨方法设计集（ProteinMPNN设计集 vs MSA设计集）互相印证，排除工具循环偏见。
无谷氨酰胺蛋白质组折叠验证
4148个蛋白全量移除谷氨酰胺（ProteinMPNN最优替代）后，平均TMscore 0.914，85.5%>0.8，与重建基线0.917/85.9%相当；按柔性分层各区间匹配。MSA方案稍弱（0.895/78%）。三路验证：局部pLDDT相关性R2=0.95；Rosetta能量R2=0.985且略稳；ESMFold TMscore斜率0.971。
低分模型非误折叠证据
约14% No-Gln模型TMscore<0.8：FoldMason显示99.2%局部完美；柔性比对救援率No-Gln与重建组持平（约61%）；BioEmu构象集合中仅2例经多重校正后显著偏离，目检同折叠。结论为低分源自本征柔性。
自然同源与跨物种保守
6369原核基因组中24%（1051/4363）大肠杆菌蛋白存在天然无谷氨酰胺同源；丰度校正后谷氨酰胺、赖氨酸、天冬酰胺“缺失同源”多于预期。酵母蛋白质组keep-score与大肠杆菌强相关（Spearman ρ=0.98），谷氨酰胺同样最低，表明框架捕捉普适结构属性。
谷氨酰胺优于异亮氨酸的判别力
同管线移除谷氨酰胺/异亮氨酸/甘氨酸：扰动Q< />
无谷氨酰胺β-内酰胺酶功能活性
TEM-1成熟酶8个谷氨酰胺替除（信号肽谷氨酰胺保留），预测TMscore 0.999；体内氨苄青霉素抗性至400 μg/mL，原位硝基头孢菌素活性带与野生型相当，证明折叠与催化功能延续。
讨论与结论翻译
讨论指出：中央结论是全蛋白质组可无谷氨酰胺且折叠在现有计算分辨率下基本不受损；keep-score两法独立收敛于谷氨酰胺，不代表“生物学可弃用”，仅指结构可替换性。谷氨酰胺无单一替代者，可替性来自上下文依赖的弱几何约束，埋藏位点更易被保留。研究局限包括：主要系计算验证，AlphaFoldDB参考亦为预测；逐位点边际最优未建模协同耦合；未覆盖折叠动力学与协同性；活性位点谷氨酰胺（如谷氨酰胺酰胺转移酶）可能功能关键。进化上谷氨酰胺代谢载荷与遗传密码历史惰性可解释其保留。未来需对必需基因系统实验测试。
研究结论（译自原文结论要旨）：中央发现是一种完整经典氨基酸可从细菌蛋白质组移除，而对几乎所有蛋白无显著结构后果；谷氨酰胺被两独立keep-score先验选为最佳靶标。在现有计算方法分辨率内，大肠杆菌蛋白质组无需谷氨酰胺即可获得天然三维折叠。当每个谷氨酰胺被ProteinMPNN最高概率替代后，序列所得AlphaFold2模型在群体上与重建天然基线匹配（均值TMscore 0.914对0.917，0.8阈值以上85.5%对85.9%）。该结果结合Liu等实验消除异亮氨酸的工作，共同表明20氨基酸字母表并非细胞生命的硬约束，并为定向重编码与最简氨基酸字母表合成生物学提供路线图。
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