《Food Chemistry》：Camel–plant protein blends modulate protein digestibility and peptidomic profiles under simulated infant gastrointestinal conditions (part I)
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本研究系统探究了脱脂骆驼乳、燕麦蛋白浓缩物、鹰嘴豆蛋白分离物及其二元混合体系在模拟6至12月龄婴儿胃肠道静态消化条件下的蛋白质消化行为与肽组学特征。研究采用经改良的婴儿体外静态消化模型，其胃蛋白酶活性设定为480 U/mL、胃液pH为4.4、胰蛋白酶活性为10
本研究系统探究了脱脂骆驼乳、燕麦蛋白浓缩物、鹰嘴豆蛋白分离物及其二元混合体系在模拟6至12月龄婴儿胃肠道静态消化条件下的蛋白质消化行为与肽组学特征。研究采用经改良的婴儿体外静态消化模型，其胃蛋白酶活性设定为480 U/mL、胃液pH为4.4、胰蛋白酶活性为100 U/mL、肠液pH为7.0，以更贴近进入辅食添加阶段婴儿的真实消化生理状态。通过邻苯二甲醛（OPA）法追踪游离氨基酸氮（AN）释放动态，结合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、反相超高效液相色谱（RP-UPLC）、毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）氨基酸定量、粒径分布分析（PSD）、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）微观结构观察以及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）肽组学鉴定等多维度技术手段，全面评估了各蛋白体系的消化特性。研究结果表明，骆驼-鹰嘴豆混合体系（CCP）在胃相与肠相均表现出最强的蛋白水解协同效应，其氨基酸氮释放量显著高于其他体系；骆驼-燕麦混合体系（CO）则因形成致密聚集体而表现出消化拮抗效应，蛋白酶可及性显著降低。在氨基酸释放层面，骆驼乳肠消化产物（CI）的总氨基酸释放量最高，且富含支链氨基酸（BCAAs）；鹰嘴豆蛋白则表现出最高的必需氨基酸与总氨基酸比值（EAA/TAA）。肽组学分析共鉴定出2539条肽段，其中CCP混合体系产生了692条肽段，接近单一蛋白源的1.4倍，且各混合体系均产生了仅存在于混合消化产物中的特征性新肽段，提示混合消化过程可暴露新的酶切位点。此外，骆驼乳中微量蛋白在肠相消化后对肽段池的贡献率高达68%，提示其在生物活性肽研究中具有被忽视的重要价值。综上所述，蛋白间的相容性与构象柔顺性是决定混合蛋白体系消化效率与肽段多样性的关键内在因素，骆驼-鹰嘴豆混合体系展现出作为婴儿营养替代蛋白基底的应用潜力。
## 论文解读
### 研究背景
随着全球对膳食蛋白质需求量的持续增长，动物蛋白生产所带来的环境负担日益受到关注，植物蛋白作为可持续食品体系的补充性替代源正受到越来越多的重视。燕麦作为谷物来源蛋白，具有降胆固醇、免疫调节及抗氧化等潜在生理功效；鹰嘴豆作为豆类来源蛋白，其所释放的生物活性肽则表现出抗高血压、抗氧化及抗炎等活性。然而，由于氨基酸组成不均衡、溶解度降低、消化率偏低以及抗营养因子存在等因素，植物蛋白完全替代动物蛋白仍面临诸多挑战。混合动物-植物蛋白体系被认为是一种极具前景的策略，可在维持可持续性的同时提供接近动物蛋白的消化率与更丰富的生物活性肽多样性。
值得关注的是，目前国际食品法典委员会（Codex Alimentarius）仅批准牛乳和山羊乳蛋白作为6月龄以下婴儿配方食品中可用的动物蛋白源，而大豆分离蛋白是目前唯一获批的植物蛋白源。骆驼乳因其蛋白质组成更接近人乳、不含β-乳球蛋白且富含β-酪蛋白等特性，在婴儿营养领域展现出独特潜力，但尚缺乏充分的长期临床与监管数据支持。与此同时，6月龄以上婴儿胃肠道与代谢功能日趋成熟，为探索包括混合动物-植物蛋白体系在内的多样化蛋白源提供了生理基础。然而，现有研究多集中于单一蛋白源在成人模拟消化条件下的消化行为，鲜有研究在婴儿生理条件下对动物-植物蛋白混合体系进行消化动力学及肽组学层面的系统表征，这一知识空白构成本研究的核心出发点。
### 研究人员开展的研究
本研究以脱脂骆驼乳、燕麦蛋白浓缩物及鹰嘴豆蛋白分离物为研究对象，设置了单一蛋白体系（C、CP、O）与三个二元混合体系（CCP骆驼-鹰嘴豆、CO骆驼-燕麦、CPO鹰嘴豆-燕麦），所有样品均按蛋白浓度3%（w/v）标准化后进行体外模拟消化。研究人员建立了一套针对6至12月龄婴儿的静态体外消化模型，该模型在胃蛋白酶活性（480 U/mL）、胃液pH（4.4）、胰蛋白酶活性（100 U/mL）及肠液pH（7.0）等关键参数上进行了优化调整，以更准确地反映进入辅食添加阶段婴儿的消化生理特征。
研究采用的关键技术方法包括：通过邻苯二甲醛（OPA）比色法对消化过程中游离氨基酸氮（AN）的释放进行定量追踪，以评估蛋白质水解程度；利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析消化前后蛋白质条带的变化以判断蛋白水解模式；运用反相超高效液相色谱（RP-UPLC）对消化产物中肽段色谱特征进行定性评估；采用毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）技术对完全消化后的氨基酸组成进行精确定量；借助激光粒度仪测定消化过程中蛋白质基质的粒径分布（PSD）参数，包括体积加权平均直径D[4,3]、表面积加权平均直径D[3,2]及百分位直径d10、d50、d90，并计算多分散系数Span以表征粒径分布宽度变化；利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合罗丹明B染色技术对消化各阶段蛋白质的微观结构进行可视化观察；最终通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术对消化产物中的肽段进行大规模鉴定与归属分析。
### 研究结果
**氨基酸氮释放动态变化（Degree of Hydrolysis Evolution）**
研究通过OPA法追踪了各体系在消化前（U）、胃相（G）及肠相（I）三个阶段的氨基酸氮浓度变化。在单一蛋白体系中，骆驼乳（C）在未消化状态下即表现出最高的基础AN浓度（3874.7 μg/mL），反映出骆驼乳中天然存在的酶与游离氨基酸；胃相消化后AN水平排序为C>CP>O，其中鹰嘴豆蛋白（CP）的消化增幅最为显著；肠相消化后，CP与C的AN水平均达到较高水平（分别为13326.7和13165.3 μg/mL），而燕麦蛋白（O）则显著偏低（3426.7 μg/mL）。在混合体系中，骆驼-鹰嘴豆混合体系（CCP）在胃相即表现出显著较高的AN水平（6371.3 μg/mL），并在肠相消化后达到最高值（12526.7 μg/mL），显著优于其他混合体系；骆驼-燕麦混合体系（CO）的最终AN值最低（5680.0 μg/mL），鹰嘴豆-燕麦混合体系（CPO）居中（8754.7 μg/mL）。从胃相到肠相的AN增幅来看，CPO（3.6倍）和CO（2.3倍）高于CCP（2.0倍），提示植物成分在肠相阶段的水解更为显著。
**SDS-PAGE蛋白质降解模式**
SDS-PAGE分析揭示了各蛋白体系在消化过程中的渐进性蛋白水解模式。单一骆驼乳（C）在消化前呈现乳铁蛋白（75 kDa）、血清白蛋白（66 kDa）、α-酪蛋白（35 kDa）、β-酪蛋白（30 kDa）、κ-酪蛋白（23 kDa）及α-乳白蛋白（14 kDa）等主要蛋白条带；胃相消化后酪蛋白条带强度显著下降，而乳清蛋白如乳铁蛋白与α-乳白蛋白表现出相对较高的抗酶解能力。鹰嘴豆蛋白（CP）呈现伴大豆球蛋白（vicilin）多个亚基（15、18、33-35、70 kDa）及豌豆球蛋白（legumin）亚基（9-10、22-24、39-47 kDa）的丰富条带图谱，胃相消化后legumin条带几乎完全降解，而vicilin条带则相对稳定。燕麦蛋白（O）在32 kDa和15 kDa处呈现12S球蛋白酸性亚基与碱性亚基的特征条带。肠相消化后，所有单一蛋白体系均表现为低分子量肽段的弥散涂抹，条带基本消失。在混合体系中，所有三个混合体系在20至75 kDa范围内呈现清晰的完整蛋白亚基条带；胃相消化后CCP和CO中20-30 kDa的中等大小条带变得不明显，而CPO中25 kDa以上的条带显著丢失。肠相消化后，CO保留了20 kDa以上的微弱条带（暗示近完全消化），CCP在37 kDa以上仍可见浅色条带（暗示不完全水解），CPO则未显示15 kDa以上的明显条带。
**氨基酸释放谱特征**
完全消化后的氨基酸定量结果显示，骆驼乳肠消化产物（CI）的总氨基酸（TAA）释放量最高（10411.8 nmol/g），约为燕麦蛋白肠消化产物（OI）的1.9倍（5362.1 nmol/g）。在必需氨基酸与总氨基酸比值（EAA/TAA）方面，鹰嘴豆蛋白肠消化产物（CPI）表现最优（52.5%），其后依次为CPOI（45.4%）和CCPI（35.5%），而COI最低（29.4%）。CPI的高EAA/TAA比值主要归因于其较高的芳香族氨基酸含量（苯丙氨酸和色氨酸），而CI则以支链氨基酸（亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）的富集为特征。层次聚类分析将肠消化产物分为骆驼主导分支与植物主导分支，其中CCPI与CI聚类相近，CPI与CPOI紧密聚集；主成分分析（PCA）的前两个主成分累计解释了88%的总方差，清晰区分了不同蛋白体系的氨基酸组成差异。
**粒径分布与微观结构变化**
在未消化状态下，脱脂骆驼乳（CU）呈现亚微米级颗粒（d50 = 0.20 μm），其CLSM图像显示均匀致密的颗粒荧光分布，符合脱脂酪蛋白胶束的特征。胃相消化后（CG），D[4,3]急剧增至45.19 μm，d50达到28.28 μm，CLSM图像呈现松散多孔的凝块状蛋白絮团结构；肠相消化后（CI）这些絮团大部分被破坏，形成精细分散的蛋白碎片分布。鹰嘴豆蛋白在未消化状态下呈现中等粒径分布（d50 = 34.65 μm），胃相消化后粒径显著减小（D[4,3] = 11.46 μm），CLSM显示细碎不规则颗粒均匀分布；肠相消化后则出现适度再聚集（D[4,3] = 21.30 μm）。燕麦蛋白在未消化状态下呈现较大的高多分散性颗粒（D[4,3] = 81.16 μm，d50 = 66.92 μm），胃相消化仅导致粒径小幅降低（Δd50 = -8.74 μm），CLSM显示微米级颗粒仍占主导；肠相消化后方出现明显的碎裂与精细分散。在混合体系中，CCP在胃相形成了类似骆驼乳的柔软凝块网络结构，肠相消化后基质发生广泛崩解（Δd50 = -51.13 μm）；CO在胃相以小颗粒部分消失、分布趋于均一化为主要特征，未出现凝块形成，肠相仅发生轻度聚集；CPO在胃相表现为颗粒尺寸显著减小的致密化过程，肠相则呈现适度的再聚集但维持较窄的分布范围。
**肽组学分析**
研究共在全部样品和消化阶段中鉴定出2539条肽段。在单一蛋白体系中，鹰嘴豆蛋白（CP）产生的肽段数量最多（487条），骆驼乳（C）次之（411条），燕麦蛋白最少（125条）。混合体系中CCP以692条肽段位居首位，约为最高单一蛋白源的1.4倍，CPO（486条）和CO（338条）依次递减。阶段特异性分析显示，胃相消化后CP和CCP分别产生318条和419条肽段，而燕麦仅产生18条；肠相消化使燕麦肽段数戏剧性增长6倍（从18增至107），而鹰嘴豆则呈现29%的下降，提示其蛋白水解在早期即趋于饱和。维恩分析显示，鹰嘴豆肠相肽段中有超过31%与胃相肽段重叠，骆驼乳和燕麦的这一比例分别约为9%和0.9%，反映出不同蛋白源肽段持续性的显著差异。
在肽段来源归属方面，骆驼乳消化产物中主要乳蛋白（酪蛋白与乳清蛋白）在胃相贡献了大部分肽段，其中CSN1S1和CSN2分别贡献22%和18%；值得注意的是，骆驼乳中微量蛋白在胃相即贡献了总肽段池的44%（源自33种不同蛋白来源），在肠相这一比例更升至68%，其中糖基化依赖性细胞黏附分子1（GLYCAM1）、乳脂肪球EGF因子8蛋白（MFGE8）及肽聚糖识别蛋白（PGLYRP）等为最主要的微量蛋白来源。鹰嘴豆蛋白肽段主要来源于7S伴大豆球蛋白（vicilin，胃相约33%）和11S豌豆球蛋白（legumin，胃相约28.7%），肠相消化后vicilin占27%、legumin占24%，近半肽段来源于各类微量鹰嘴豆蛋白，其中脂氧合酶来源的肽段最为丰富。燕麦蛋白肽段则以醇溶蛋白（prolamin，胃相50%）和12S球蛋白（44.4%）为主要来源，肠相后肽段来源更为多样化，新增了胰蛋白酶抑制剂来源的肽段（5%）。
在混合体系的肽段来源归属中，CCP在胃相消化后鹰嘴豆来源肽段占78%（其中vicilin与legumin合计贡献超过半数），骆驼来源占22%，微量骆驼蛋白占骆驼肽段的45%；肠相后鹰嘴豆仍为主要来源（62%），骆驼来源增至38%，且微量骆驼蛋白的贡献进一步凸显（49条肽段）。维恩分析表明，CCP胃相肽段有72.6%与CPG重叠、8.6%为混合体系特有；肠相分别有55%与CPI重叠、31.5%与CI重叠、37条为混合体系特有。CPO在胃相和肠相均以鹰嘴豆来源肽段为主（分别占92%和72%），与燕麦消化产物的重叠度较低（6%和32.5%），分别产生16条和8条混合体系特有肽段。CO在胃相高度偏向骆驼蛋白来源（78%），肠相后骆驼来源降至59%，且微量骆驼蛋白来源的肽段占骆驼肽段的65%，同时出现了7条燕麦胰蛋白酶抑制剂来源的肽段，产生14条混合体系特有肽段。
### 讨论与结论
本研究的讨论部分从蛋白组成、胶体稳定性、溶解度及分子间相互作用等多维度深入阐释了不同混合体系消化行为差异的内在机制。研究指出，骆驼乳蛋白以酪蛋白（70-80%）和乳清蛋白（20-30%）为主，具有高度的结构柔顺性与胶体分散性，在胃相条件下（pH 4.4）形成柔软凝块而非致密聚集体，从而维持对胃蛋白酶的持续可及性。鹰嘴豆和燕麦蛋白虽然在等电点范围上与骆驼酪蛋白相似，但缺乏胶束组织结构与构象柔顺性，在pH从碱性降至酸性的过程中因静电排斥力减弱而易于聚集，溶解度显著下降。在肠相条件下（pH 7.0、0.1 M NaCl），两种植物蛋白均可因表面负电荷增加而提高溶解度与酶可及性，但燕麦蛋白的溶解度和酶解抗性仍显著优于鹰嘴豆蛋白，这归因于燕麦蛋白较不陡峭的ζ-电位-pH响应曲线、较高的离子强度下更显著的静电屏蔽效应以及β-葡聚糖和致密β-_sheet结构对酶切位点的物理遮蔽。
CCP混合体系表现出的协同消化效应可归因于骆驼酪蛋白消化产生的含水多孔聚集体持续易受胃蛋白酶作用，同时酪蛋白的固有缓冲能力可将鹰嘴豆蛋白维持在等电点以上以保持其溶解与分散状态；此外，部分解折叠的鹰嘴豆蛋白因加工处理而增加了表面积与结构柔顺性，促进了蛋白间相互作用与酶可及性。相比之下，CO混合体系中燕麦蛋白可能被包埋于骆驼酪蛋白凝块基质中，限制了酶的可及性，且燕麦浓缩物中保留的β-葡聚糖、多酚及酶抑制剂等成分可能进一步抑制蛋白水解或促进致密凝胶网络的形成。本研究与既往关于蚕豆蛋白、豌豆蛋白部分替代乳清蛋白以及燕麦-牛乳混合体系的研究结果一致，均强调了动植物蛋白间在溶解度与聚集行为上的相容性是决定性因素。
在氨基酸释放方面，CCPI在氨基酸组成上处于CI与CPI之间的互补平衡位置，支链氨基酸释放接近CI水平，而芳香族氨基酸释放较CI单独显著增加，实现了氨基酸组成的互补优化。研究同时指出，CPI和CPOI所表现出的高EAA/TAA比值主要受芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸）驱动，可能高估了这些蛋白源的真实功能质量；排除这三种芳香族氨基酸后，CI反而成为最稳健的必需氨基酸贡献者，反映了更为均衡且功能适当的氨基酸谱。
在肽段释放层面，CCP混合体系较单一骆驼或鹰嘴豆蛋白产生了约多40%的肽段，其中胃相和肠相分别有8.6%和13.5%为混合体系特有序列，提示混合消化过程能够暴露此前无法接近的酶切位点，可能源于构象变化、三级或四级堆积的改变以及蛋白间新的界面相互作用。而CO和CPO中有限界面相容性与水合作用可能导致致密聚集体形成，遮蔽内部肽键，限制了水解程度与新肽段的生成。
研究结论指出，蛋白相容性与构象柔顺性是决定骆驼-植物蛋白混合体系消化效率与肽段谱特征的关键内在决定因素。CCP混合体系在消化程度、氨基酸氮与氨基酸释放以及肽段多样化方面均表现出显著的协同效应，并产生了大量混合体系特有的肽段，展现出作为婴儿营养替代蛋白基底的良好应用前景。CO和CPO体系则因蛋白间相容性差及致密聚集体形成而呈现拮抗消化模式。未来研究应优先采用动态消化模型结合动力学与定量肽组学分析，进一步阐明骆驼-鹰嘴豆蛋白相互作用的界面分子机制，评估工业加工工艺（均质化、巴氏杀菌、喷雾干燥）对蛋白结构与肽段生成的影响，并通过细胞实验与体内模型验证所释放肽段的生物利用度与代谢命运，从而为这类混合蛋白体系在婴儿可持续营养系统中的功能应用开发提供机制性与转化性科学依据。本研究发表于《Food Chemistry》期刊。
