基于AgNPs@CFM/滤纸的信号增强拉曼组学用于解析粉末香辛料中细菌芽孢结构差异及快速检测

《Food Chemistry: X》：Signal-enhanced Ramanomics based on AgNPs@CFM/filter paper: Decoding structural differences of bacterial spores in powdered spices and realizing rapid detection

　　

粉末香辛料在生产、贮藏和流通中易受细菌芽孢污染，传统检测方法样品前处理繁琐、周期长且设备依赖强。本研究构建基于AgNPs@CFM/滤纸（AgNPs@CFM/filter paper）的“过滤-增强”一体化表面增强拉曼散射（SERS）传感器，结合拉曼组学与化学计量学算法，间接解析粉末香辛料中细菌芽孢的结构差异，并实现快速定性与定量检测；在加标香辛料中，芽孢定性识别准确率达到100%，并实现细菌芽孢的快速定量。

Shijie Liu等围绕粉末香辛料中细菌芽孢的快速检测开展研究。粉末香辛料是植物根、茎、叶、花、果实和种子经清洗、干燥、粉碎和包装等制成的干燥粉末状天然调味品，包括辣椒粉、黑胡椒粉、花椒粉、姜粉和大蒜粉等，广泛用于预制餐、休闲食品、肉制品和调味品。其生产、贮藏和流通环境易导致土壤、水源和加工环境微生物污染。细菌芽孢是革兰阳性菌在恶劣环境下形成的休眠体，耐热、耐干燥和耐化学消毒剂，常规灭菌难以完全灭活，是威胁食品安全和制约产业发展的核心风险因子。常见芽孢包括Clostridium perfringens、Bacillus subtilis、Bacillus cereus和Bacillus licheniformis，部分菌株产生肠毒素和呕吐毒素，低浓度即可引起急性胃肠炎、呕吐和腹泻；全球食源性疾病监测显示由芽孢杆菌及其代谢物引起的中毒长期居微生物性食物中毒前列。因此，快速准确检测粉末香辛料中细菌芽孢具有现实必要性和紧迫性。传统平板培养、PCR和质谱鉴定准确性较高，但样品前处理繁琐、检测周期长、设备依赖强，难以满足大量香辛料快速筛查；粉末香辛料基质复杂，多酚、色素和纤维素等干扰严重，传统方法灵敏度和特异性不足。SERS（表面增强拉曼散射）具有指纹光谱特异性、检测速度快和灵敏度高，可借助纳米结构表面电磁场增强放大目标分子拉曼信号，直接捕获细菌芽孢中Ca²⁺-DPA（钙二吡啶甲酸）、蛋白质和肽聚糖等关键成分的特征指纹峰，兼具定性识别和定量分析能力，并被称为信号增强拉曼组学（Signal-enhanced Ramanomics）。但已报道的SERS微生物检测多聚焦营养细胞，对细菌芽孢的系统研究相对有限；多数研究集中于单一目标菌而非多种产芽孢菌比较，芽孢结构异质性相关光谱特征及其判别应用认识不足。为此，Shijie Liu等选择7株粉末香辛料中常见的代表性产芽孢菌，构建“过滤-增强”一体化AgNPs（银纳米颗粒）@CFM（纤维素滤膜）/滤纸SERS平台，结合拉曼组学和PCA（主成分分析）、SCA（原文所用聚类分析算法）、LDA（线性判别分析）和PLS-DA（偏最小二乘判别分析）研究芽孢光谱差异并建立定性和定量模型，最后用人工接种香辛料评价复杂食品基质中的可行性。研究得出该平台增强因子（EF）为13991.00，7种芽孢最强特征峰SERS强度RSD（相对标准偏差）低于13%，12 d内SERS活性稳定；7种芽孢Ca²⁺-DPA暂定振动模式和强度存在差异，I_1374–1398/I_997–1017和I_1561–1588/I_997–1017呈种依赖模式；PCA、LDA、SCA和PLS-DA实现快速分类鉴定，LDA在光谱水平留一交叉验证（LOOCV）中准确率、灵敏度和特异性均为100%；定量模型R²=0.99，覆盖10²–10⁷ CFU/mL；人工加标花椒粉、辣椒粉和黑胡椒粉中LDA定性准确率100%，平均定量准确率99.21%，RSD为1.19%–2.45%。该研究为基于SERS拉曼组学分析芽孢组分和结构差异提供理论支持，对完善食品安全防控体系具有工业价值和科学意义。
关键技术方法：7株芽孢形成菌（C. perfringens HL11、B. subtilis HL23、B. cereus HL85、B. amyloliquefaciens HL62、B. licheniformis HL164、B. velezensis HL331和B. altitudinis HL104）由河南农业大学食品科学技术学院微生物实验室从香辛料中分离并保存于?80 °C。研究人员以柠檬酸钠还原法制备AgNPs，将CFM与滤纸复合，经油/水界面自组装形成AgNPs@CFM/滤纸SERS基底；以532.8 nm激光、25 mW、100×物镜、30 s采集400–1800 cm^?1光谱；结合拉曼组学及PCA、SCA、LDA、PLS-DA建模，并在花椒粉、辣椒粉、黑胡椒粉人工加标样本中验证。
研究结果：3.1 AgNPs及AgNPs@CFM/滤纸表征：通过UV–Vis、TEM、粒径分析和SEM表征，AgNPs呈球形、平均约66 nm，SPR峰432 nm，AgNPs可固定于CFM形成致密纳米颗粒阵列，芽孢可加载且不破坏基底结构，双层复合纸多孔结构可快速吸湿、富集固定芽孢并降低咖啡环效应。3.2 AgNPs@CFM/滤纸性能测试：通过7种芽孢SERS与普通拉曼比较计算EF=13991.00；基底在12 d内对C. perfringens和B. subtilis芽孢保持稳定SERS活性；7种芽孢20次重复最强特征峰RSD<13%，5批基底批间RSD分别为7.18%和8.40%，表明增强、重现性和批间一致性良好。3.3 信号增强拉曼组学分析：对原始光谱去宇宙射线、基线校正和Savitzky–Golay平滑后，比较7种芽孢平均SERS谱和二维映射，发现各菌具有可区分的特征峰；Ca²⁺-DPA相关峰强度及I比值存在种间差异，可提供判别特征，但作者强调未直接测Ca²⁺、DPA和水含量，相关解释为间接光谱关联。3.4 分类鉴定模型：以140条SERS光谱（每株20条技术重复）建模，PCA可区分7种芽孢，PC1–PC3累计贡献率72.4%；LDA实现完全分离，LOOCV准确率、灵敏度和特异性均100%；SCA形成7个聚类且C. perfringens与其他Bacillus分开；PLS-DA拟合R²=0.99、Q²>0.8，5折交叉验证Q²=0.99，1000次置换检验支持模型准确性；VIP>1的差异峰涉及Ca²⁺-DPA、Amide II、PO₂^?、蛋白CH₂/Amide III、二硫键和苯丙氨酸等。3.5 SERS数字定量模型：在10²–10⁷ CFU/mL范围采集7种芽孢SERS谱，以最强Ca²⁺-DPA峰构建浓度对数与峰强度定量方程；C. perfringens（1578 cm^?1）y=4181.45x?3397.44（R²=0.99），B. subtilis y=2512.37x?2188.78（R²=0.99），B. cereus y=4644.92x?3183.10（R²=0.99），其余见原文补充；该概念验证未确定LOD/LOQ。3.6 人工加标香辛料验证：花椒粉、辣椒粉和黑胡椒粉经121 °C、30 min灭菌后接种芽孢，经浸泡、离心、过滤和洗涤分离芽孢后采集SERS；以黑胡椒粉为例，LDA对7种芽孢光谱分类准确率100%；对C. perfringens、B. subtilis和B. cereus定量预测准确率98.62%–99.70%，平均99.21%，RSD 1.19%–2.45%；作者指出验证基于技术重复，基质经热处理和过滤，不能完全代表自然污染商业香辛料。
讨论部分总结：作者明确本研究结果来自技术重复光谱而非独立生物学重复，模型指标主要反映光谱判别能力；短期稳定性仅评估2株、12 d；未测定LOD/LOQ；未直接测Ca²⁺、DPA、含水量和芽孢成熟度；采样基于显微识别区域，可能存在采样偏倚；加标基质经灭菌、洗涤和过滤，未完全反映自然污染商业香辛料复杂性。后续需扩大菌株库和多产孢批次，纳入对照菌株，采用Raman mapping和系统采样评估空间异质性，使用未处理商业香辛料和更多基质、独立生物重复及外验证集，并系统确定LOD/LOQ。
研究结论翻译：本研究制备了“过滤-增强”一体化AgNPs@CFM/滤纸SERS传感器，并结合多尺度物理分级耦合技术构建了香辛料中细菌芽孢快速识别和定量检测策略。材料表征显示EF为13991.00，7种芽孢最强特征峰SERS强度RSD低于13%，12 d内具有良好芽孢检测性能，表明基底增强效果、重现性和贮存稳定性良好。7种芽孢的信号增强拉曼组学结果显示，Ca²⁺-DPA暂定振动模式和含量存在显著差异，可作为分类鉴定关键指标；I_1374–1398/I_997–1017和I_1561–1588/I_997–1017呈明显种依赖光谱模式；PCA、LDA、SCA和PLS-DA均实现快速分类鉴定。人工加标香辛料再接种验证中，结合LDA模型的快速识别预测准确率为100%，平均定量准确率为99.21%。该研究为基于SERS代谢组学技术分析芽孢组分和结构差异提供理论支持，对提升食品安全防控体系具有重要工业价值和科学意义。但结果基于技术重复光谱而非独立生物学重复，后续需扩大菌株库，覆盖多菌株和不同产孢批次，以提高判别模型稳健性和跨批次适用性，并纳入适当对照菌株研究不同芽孢组分对SERS指纹的贡献。