《Food Chemistry》：Nanosecond pulsed electric field (nsPEF) processing better preserves donor human milk digestibility than holder pasteurisation during dynamic
in vitro term infant digestion
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纳秒脉冲电场（nsPEF）处理在动态体外足月婴儿消化过程中比Holder巴氏杀菌（HoP）更好地保留供体母乳的可消化性。•首项在nsPEF处理的母乳中开展的体外消化研究。•nsPEF在消化过程中比HoP保留了更强的完整乳铁蛋白条带。•nsPEF处理的母乳比Ho
纳秒脉冲电场（nsPEF）处理在动态体外足月婴儿消化过程中比Holder巴氏杀菌（HoP）更好地保留供体母乳的可消化性。•首项在nsPEF处理的母乳中开展的体外消化研究。•nsPEF在消化过程中比HoP保留了更强的完整乳铁蛋白条带。•nsPEF处理的母乳比HoP处理的母乳保持了更接近生乳的消化特征。•nsPEF增强蛋白质消化率并比HoP更好地保留脂质特征。
**一、研究背景与目的**
母乳（human milk, HM）是婴儿出生后前六个月的主要且唯一的营养来源。当母亲自身乳汁不可用时，供体母乳（donor human milk, DHM）被提供给住院的早产儿或极低出生体重儿，以降低坏死性小肠结肠炎（necrotising enterocolitis, NEC）的风险。DHM也用于住院足月儿，尤其是伴有严重并发症或在术前术后的婴儿，以促进肠道喂养并改善喂养耐受性，因此其可消化性对于支持婴儿生长和康复至关重要。DHM的常规巴氏杀菌方法为Holder巴氏杀菌（Holder pasteurisation, HoP），也称低温长时间（low-temperature long-time, LTLT）处理，在62.5 °C下处理30 min。然而，这一较高的加工温度可能损害DHM中的许多必需营养素。近年来，高压处理（high-pressure processing, HPP）、脉冲电场（pulsed electric fields, PEF）和紫外线C照射等非热巴氏杀菌方法被探索作为保留DHM品质的替代方案。此前对PEF处理的研究显示了其微生物灭活效果，以及相比HoP能更好地保留HM中的必需酶和生物活性成分。然而，PEF加工对HM消化的影响尚未在动态条件下得到研究，这正是本研究的目的。评估PEF处理的HM的可消化性至关重要，因为这涉及乳样中脂肪分解和蛋白质水解等关键过程，与婴儿的生长和发育直接相关。脂质占HM总能量的50%以上，提供婴儿所需的必需营养素，与细胞增殖、肠道细胞成熟、神经和大脑发育等功能相关。蛋白质不仅为婴儿提供氨基酸，还提供抗菌活性，支持消化和营养吸收。因此，有必要进行蛋白质水解和脂质组学分析，以评估处理对蛋白和脂质消化的影响。由于体内干预试验成本高昂且常因伦理等问题不可行，体外消化是理想的替代方案。动态消化模型比静态模型更能真实地模拟胃肠道消化管和消化阶段之间的瞬态，因此本研究采用动态体外足月婴儿模型，分析PEF处理的HM与生乳（raw human milk, RHM）和HoP处理的HM在蛋白质水解和脂肪分解方面的差异。
**二、研究方法**
研究人员从澳大利亚红十字会Lifeblood母乳库（Brisbane, Australia）获取DHM，伦理批准由澳大利亚红十字会Lifeblood人类研究伦理委员会（2023#28-LNR）和昆士兰大学人类研究伦理委员会（2023/HE001753）提供。收集的母乳在产后前三个月内挤出，汇合后分成三批：一批为未处理生乳（RHM），一批在62.5 °C下HoP处理30 min（HoP-HM），另一批采用纳秒脉冲电场（nanosecond pulsed electric field, nsPEF）处理（PEF-HM），处理参数基于研究人员此前研究。所有实验进行三次重复。动态体外足月婴儿消化系统参照De Oliveira, Deglaire等人（2016）的方法并作修改，采用LabVIEW软件计算机控制，模拟胃期和肠期，在120 min内每30 min从胃和肠相采样。采用共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）观察微结构，Mastersizer 2000测定粒径分布，Pierce? BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白浓度，三氯乙酸法测定蛋白水解度，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）分析蛋白条带，靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行脂质组学分析（覆盖20个脂类、588种脂质分子种），并采用LC-MS/MS定量10种游离脂肪酸（free fatty acids, FFA）浓度。
**三、研究结果**
**3.1 微结构和粒径**
CLSM和粒径分析显示，HoP-HM在消化前（G0）呈现更大的平均粒径（D[4,3] = 12.31 ± 0.63 μm），显著高于RHM（5.43 ± 0.10 μm）和PEF-HM（8.23 ± 1.03 μm），这可能是热诱导蛋白在乳脂肪球周围聚集或重组所致，而nsPEF处理最高温度不超过36 °C，故未出现明显粒径增大。胃消化60 min时，RHM和PEF-HM因乳剂失稳出现更大颗粒，HoP-HM则保持准稳态。所有样品在胃期末（G120）出现双峰分布，但HoP-HM的第二峰体积百分比更高且平均直径略大。肠期样品中，HoP-HM持续表现出相对更大的脂肪-蛋白质聚集体。总体而言，HoP-HM在所有消化阶段均呈现更大的粒径，这可能与热变性蛋白在脂肪球表面的重组有关。这些较大聚集体可能对胃排空动力学和脂肪分解效率有潜在生理影响，但需体内研究确认。
**3.2 蛋白质水解**
蛋白浓度随消化进程逐渐降低，在胃期末（G120）达到最低，RHM的蛋白浓度在G0为15.7 ± 0.9 g/L，HoP-HM和PEF-HM分别为13.8 ± 0.6 g/L和13.9 ± 0.7 g/L，差异不显著。蛋白水解百分比随消化时间延长而增加，在G30、I90和I120时间点，PEF-HM表现出显著增强的蛋白质消化率（p < 0.05）。PEF处理可能通过改变静电相互作用、氢键和二硫键，诱导蛋白质四级、三级和二级结构的构象改变，导致部分蛋白去折叠，从而暴露疏水性和易感区域，提高胃肠道蛋白酶活性位点的可及性，增强酶解效率。
**3.2.1 SDS-PAGE**
SDS-PAGE分析显示，消化前（G0）三种HM样品的蛋白条带无明显差异，均清晰可见粘蛋白（mucins）、黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase, XO）、乳铁蛋白（lactoferrin）、血清白蛋白（serum albumin）、酪蛋白（caseins）和α-乳白蛋白（α-lactalbumin）条带。胃消化90 min后，HoP-HM的粘蛋白和XO条带开始变浅，乳铁蛋白条带减弱，而RHM和PEF-HM仍保留清晰的完整乳铁蛋白条带。HoP-HM的酪蛋白条带在G90和G120时强度更高，提示热变性导致酪蛋白水解减少。在肠期，高分子量蛋白（粘蛋白和XO）在所有样品中均完全消化，完整乳铁蛋白在所有样品中均被观察到，但HoP-HM的乳铁蛋白条带持续弱于RHM和PEF-HM，PEF-HM的完整乳铁蛋白条带最强。酪蛋白在肠期完全水解。血清白蛋白和α-乳白蛋白在三种样品间总体无显著差异，但在I120时PEF-HM的血清白蛋白条带略深。
**3.3 脂解和游离脂肪酸分析**
靶向脂质组学分析检测到570种脂质分子种。主成分分析（principal component analysis, PCA）得分图显示，样品主要按消化阶段分组而非处理方式分组，表明消化过程是主导因素。G0样品与消化后样品沿第一主成分显著分离，其中降低的脂质主要为磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine, PC）和磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol, PI），增加的脂质包括神经酰胺（ceramide, Cer）、甘油二酯（diglyceride, DG）、二氢神经酰胺（dihydroceramide, dhCer）、己糖神经酰胺（Hexosylceramide, HexCer）和溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine, LPC）。双因素方差分析（two-way ANOVA）显示174种显著差异脂质（p < 0.05），其中146种仅受消化阶段影响，26种受处理与消化阶段交互作用影响。仅在G0样品的单因素方差分析显示，与RHM相比，HoP导致多种甘油磷脂和鞘脂显著减少，而nsPEF处理后大多数此类脂质相对丰度高于RHM，提示nsPEF能更好地保留天然脂质组成。对G120和I120样品分别进行单因素方差分析，未发现显著差异的脂质，说明随着消化进行，处理间的脂质差异趋于消失，消化过程主导了脂质谱的演变。
**3.3.1 游离脂肪酸分析**
10种FFA的定量分析显示，消化前RHM通常维持较高的FFA浓度，主要成分为油酸（C18:1，64%）、亚油酸（C18:2 ω-6，13%）和α-亚麻酸（C18:3 ω-3，6%）。HoP-HM在G0时多种单不饱和FA和多不饱和FA（PUFA）浓度显著低于RHM和PEF-HM，而PEF-HM与RHM的FFA浓度总体无显著差异。消化后，所有样品的FFA浓度在胃期下降，在肠期回升，但处理间无显著差异，表明消化过程使处理效应被掩盖。
**四、讨论与结论**
研究表明，nsPEF处理的HM在动态体外足月婴儿消化中表现出比HoP处理的HM更接近RHM的消化特征。HoP导致更大的脂肪-蛋白质聚集体、较少的酪蛋白水解和更多的乳铁蛋白降解，而nsPEF处理保留了更小的粒径、更高的蛋白质消化率和更完整的乳铁蛋白。脂质组学和FFA分析进一步表明，nsPEF处理的HM在消化前具有更接近RHM的脂质谱，而HoP导致多种脂质成分减少。然而，在消化过程中，消化本身的主导作用逐步消弭了处理间的脂质差异，提示广泛的胃肠道脂解足以覆盖加工引起的脂质修饰。讨论部分指出，HoP-HM的较大聚集体可能对胃排空和脂肪分解有潜在影响，但现有体内证据有限，且本文未直接测量胃排空或脂肪吸收，需体内研究确认临床意义。nsPEF处理可能通过电穿孔机制部分展开蛋白质结构，增强蛋白酶可及性，但其对蛋白质生物活性的影响尚待直接功能测定。总体而言，nsPEF作为一种非热加工技术，有望替代HoP进行供体母乳加工，但需在早产儿消化模型和体内试验中进一步验证，并评估微量营养素保留和长期生长结局。该研究首次评估了nsPEF处理的HM在动态体外婴儿消化模型中的可消化性，为nsPEF作为供体母乳加工方法的可行性提供了重要基础。论文发表于《Food Chemistry》（食品化学）。
