印度东南海岸Manauli岛红藻Halymenia floresii硫酸化多糖亲水胶体的化学表征及其作为功能食品的评价

《Food Hydrocolloids for Health》：Chemical Characterization and Evaluation of a Sulfated Hydrocolloid Isolated from Red Algae Halymenia floresii as a Functional Food from Manauli Islands, Southeast Coast of India

　　

海洋红藻是结构多样的硫酸化多糖的重要来源，这些多糖在多个领域具有广阔的应用前景。本研究从印度东南海岸Manauli岛采集的红藻Halymenia floresii中分离出硫酸化多糖亲水胶体。通过多种分析技术进行广泛的化学表征后，所分离的多糖（分子量365 kDa）显示含有与硫酸酯基团连接的葡萄糖（79 mol.%）和半乳糖（20.98 mol.%）。通过流变学研究确认了该硫酸化多糖的胶凝特性，同时其还表现出显著的抗凝血、益生元和抗氧化潜力。此外，研究人员使用MTT法在正常细胞系（HEK 293和L929细胞）和癌细胞系（SiHa和HeLa）上评估了该多糖的安全性，发现其对癌细胞具有细胞毒性，而对正常细胞安全。总之，从可食用藻类Halymenia floresii中提取的硫酸化多糖亲水胶体，凭借其结构和理化特性，有望作为一种具有前景的生物活性聚合物，应用于制药和营养保健品领域。

## 论文解读：红藻Halymenia floresii硫酸化多糖亲水胶体的结构表征与功能评价

### 一、研究背景与目的

全球范围内，从天然资源中开发新型生物聚合物的需求日益增长，主要源于其在食品和制药工业中的广泛应用。海洋覆盖了地球表面近70%，栖息着最丰富的物种多样性，其中蕴含着大量未被开发的生物活性化合物资源。海洋环境具有高盐度、静水压和温度波动等极端且多变的特点，海洋生物通过产生多种生物分子来适应这些环境压力。在多样的海洋生物活性化合物中，硫酸化多糖（sulfated polysaccharides）最为丰富，因其可生物降解性、低毒性和良好的生物相容性而被认为是营养保健品和药理学应用的重要候选物质。已有研究报道了硫酸化多糖在药物递送系统、生物传感器、伤口愈合生物材料和 hydrogel（水凝胶）等多种生物医学领域的应用。

硫酸化多糖是由被硫酸酯基团取代的单糖单元组成的阴离子聚合物，这些基团赋予多糖负电荷。这类大分子大量存在于海藻细胞壁中，帮助藻类附着于基质并作为抵御病原体的屏障。在海洋藻类中，红藻（Rhodophyta）是细胞壁硫酸化多糖的丰富来源，如琼脂（agar）、卡拉胶（carrageenan）和硫酸化半乳聚糖（sulfated galactan）。这些多糖由于具有胶凝、增稠和稳定特性而被视为 hydrocolloids（亲水胶体），被认为是食品工业中的潜在功能因子。此外，红藻多糖还表现出多种生物活性，如抗氧化、抗凝血、抗炎、降血糖、抗糖尿病和神经保护作用。大多数来自红藻的多糖是可溶性膳食纤维，能够调节肠道微生物群落的生长，可用作益生元补充剂。

Halymenia floresii，俗称海莴苣，是一种可食用的红藻，主要生长在3至40米深度的岩石基质之间。根据AlgaeBase数据库，Halymenia属包含72个物种，但只有少数如H. dilatata、H. durvillei、H. porphyroides、H. venusta、H. ceylanica和H. floresii已被探索研究。然而，针对Halymenia属物种中硫酸化多糖的研究十分有限。已有一些研究报道了从Halymenia floresii中提取的粗多糖具有抗病毒、抗疱疹和抗凝血特性，但其硫酸化多糖的结构和功能特性尚未得到充分研究，且作为亲水胶体的潜在应用值得探索。因此，本研究旨在调查来自印度东南海岸的Halymenia floresii多糖的结构、理化性质和生物活性潜力，以阐明未开发海藻多糖的结构与理化及生物学性质之间的关系。

### 二、研究内容与主要结论

研究人员从印度东南海岸Manauli岛（位于Tamil Nadu邦Rameshwaram的Gulf of Mannar地区，纬度9°12.568′北，经度79°08.634′东，海拔10米）采集了深海红藻Halymenia floresii，并通过CSMCRI（Mandapam coast, Tamil Nadu, India）进行了物种鉴定。采用改良的提取方法获得硫酸化多糖（命名为HFP），得率为35.6±1%。通过化学组成分析、光谱学分析、色谱分析、流变学测量以及一系列体外生物活性测定，对HFP的结构和功能进行了表征。

研究得出以下主要结论：HFP是一种分子量为365 kDa的异质性硫酸化多糖，主要由葡萄糖（79 mol.%）和半乳糖（20.98 mol.%）组成，含有较高的硫酸酯基含量（27.7±0.2%）、尿嘧啶酸（7.8%）、丙酮酸（1.14±0.45%）和少量蛋白质（2.8%）。FTIR光谱分析表明HFP含有硫酸酯基团（S=O，1254.84 cm?1）、糖苷键（C-O-C，1025.48 cm?1）和尿嘧啶酸的羧基（COO，1646 cm?1）等特征官能团，其中834.30 cm?1处的吸收带指示了D-半乳糖-2-硫酸酯（G2S）的存在，而934.21 cm?1处的弱信号可能对应于3,6-脱水半乳糖，该基团有助于多糖的胶凝特性。固态13C NMR光谱显示，HFP与来自红藻Gigartina caniculata的λ型卡拉胶具有相似的峰型，进一步证实了其硫酸化半乳聚糖的结构特征。流变学测试表明，HFP溶液在低剪切速率下具有较高粘度，在高剪切速率下表现出剪切变稀行为，流动行为指数（n）为0.918，确认了其弱假塑性流体特征，符合亲水胶体的典型流变特性。体外活性研究表明，HFP具有浓度依赖性的抗氧化活性（DPPH IC?? = 3.2±0.5 mg/mL；FRAP IC?? = 11.79±0.3 mg/mL），因硫酸酯基位于C2位而表现出较低的抗氧化能力；在凝血酶原时间（PT）试验中，HFP以剂量依赖方式延长了凝血时间，且在1500 μg/mL以上浓度时完全抑制了凝血块的生成，显示出与肝素可比的抗凝血活性（通过抑制外源性凝血途径）；益生元实验表明HFP能促进婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）的生长，其效果优于商业益生元菊粉（inulin）；细胞毒性实验显示HFP对正常细胞（HEK 293和L929）无毒性，而对宫颈癌细胞SiHa表现出剂量依赖性细胞毒性（IC?? = 120 μg/mL），但HeLa细胞对该多糖的毒性不敏感。AO/EB双荧光染色进一步证实HFP可通过诱导凋亡（早期和晚期凋亡）来发挥对SiHa细胞的细胞毒作用。

### 三、关键研究方法

本研究采用的主要技术方法包括：采用热水提取和乙醇沉淀法从红藻中提取多糖；使用苯酚-硫酸法、硫酸钡-明胶法和咔唑法分别测定总糖、硫酸酯和尿嘧啶酸含量；采用AOAC gravimetric酶法（991.43）测定总膳食纤维含量；使用CHNS元素分析仪测定C、H、N、S元素组成；采用PMP柱前衍生化HPLC法测定单糖组成；利用UV-Vis和FTIR光谱分析官能团信息；使用凝胶渗透色谱（GPC）测定分子量和均一性；采用固态13C CP/MAS NMR光谱进行结构解析；使用流变仪（MCR92 Rheometer，Anton Paar）评估流变性质。生物活性评估方面，采用DPPH和FRAP法测定抗氧化活性，PT法测定抗凝血活性，通过益生菌培养实验测定益生元活性，使用MTT法和AO/EB荧光染色评估细胞毒性和凋亡诱导效应。

### 四、研究结果概要

#### 3.1 HFP多糖的得率与化学组成

通过水提法从Halymenia floresii中获得的粗多糖（HFP）得率为35.6±1%，高于同属其他物种的报道值。化学组成分析显示，HFP由总糖（53.65±0.03%）、硫酸酯（27.7±0.2%）、尿嘧啶酸（7.8±1.2%）、丙酮酸（1.14±0.45%）和微量蛋白质（2.8±0.5%）组成，较高的硫酸酯含量确认了其硫酸化性质。总膳食纤维含量为34±0.2%，与Halymenia venusta的硫酸化多糖（35.1%）相似。CHNS分析进一步验证了碳（26.11%）、硫（9.99%）、氢（1.5%）和氮（1.22%）的元素组成，与已报道的硫酸化多糖一致。

#### 3.2 HFP的结构表征

HPLC分析表明HFP主要由葡萄糖（79 mol.%）和半乳糖（20.98 mol.%）组成，不含其他单糖组分。UV-Vis光谱显示在260 nm和280 nm处无显著吸收峰，表明多糖中无核酸和蛋白质污染。FTIR光谱确认了羟基（3445.97 cm?1）、C-H键（2934.21 cm?1）、羧基（1646 cm?1）、硫酸酯基（1254.84 cm?1）、糖苷键（1025.48 cm?1）、G2S硫酸酯（834.30 cm?1）以及3,6-脱水半乳糖（934.21 cm?1）等特征吸收峰的存在。虽然HFP的GPC色谱图呈现两个峰，提示其异质性，但平均分子量为365 kDa，多分散指数（PDI）为1.5，与红藻硫酸化多糖的高分子量和多分散性特征相符。固态13C NMR谱中的主要峰（101.72、93.87、75.95和67.2 ppm）与λ型卡拉胶的标准峰相似，其中101.72和93.87 ppm分别归属于β-D-半乳糖-2-硫酸酯（G2S）和α-D-半乳糖-2-硫酸酯（D2S）的异头碳C1；176.40和25.89 ppm处的弱信号分别归属于羧基和甲基，证实了丙酮酸基团的存在。

#### 3.3 HFP的流变学特征

流变学研究表明HFP溶液在1% w/v浓度下表现出剪切变稀（shear-thinning）行为：在低剪切速率区，表观粘度几乎恒定，随剪切速率增加粘度逐渐降低。将实验数据拟合Ostwald-de Waele幂律模型，得到流动行为指数（n）为0.918（n<1），确认了其弱假塑性流体行为。这种流变特性与多糖中较高含量的硫酸酯和尿嘧啶酸有关，这些基团通过增强分子负电荷密度和延伸分子构象来增加粘度。

#### 3.4 HFP的生物活性

DPPH和FRAP抗氧化实验显示HFP的抗氧化活性呈剂量依赖性但总体较弱，IC??值分别为3.2±0.5 mg/mL和11.79±0.3 mg/mL。研究发现，位于C2位的硫酸酯基团降低了多糖的供氢能力，导致其低抗氧化活性，这与FTIR光谱检测到的C2位硫酸酯取代一致。

PT试验结果显示HFP的抗凝血活性呈浓度依赖性：从低浓度起凝血时间逐渐延长，在1500 μg/mL浓度以上完全抑制凝血块形成；而标准肝素在500 μg/mL浓度时即实现完全抑制。抗凝血作用机制可能涉及对PT所反映的外源性凝血途径的抑制。尽管HFP的C2位硫酸酯取代模式使其抗凝血活性弱于2,3-二硫酸酯化的半乳聚糖，但仍表现出与肝素可比的抗凝效果。

益生元实验表明，与基础MRS培养基（对照）和商业益生元菊粉相比，添加0.5%~2.0% HFP的培养基能更有效地促进婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）的生长，且促进效果与HFP浓度呈正相关。HFP的可溶性膳食纤维特性和适当的分子量被认为在其益生元活性中起关键作用。

MTT细胞毒性结果显示，在25~400 μg/mL浓度范围内，HFP对HEK 293胚胎肾细胞和L929成纤维细胞均保持80%以上的细胞活力，证实其对正常细胞具有良好的生物相容性。在癌细胞系中，HFP对SiHa细胞显示出剂量依赖性细胞毒性，IC??值为120 μg/mL；而HeLa细胞对相同剂量范围的HFP不敏感，这可能与两种细胞系中HPV拷贝数差异有关。

#### 3.5 AO/EB染色分析

AO/EB双荧光染色结果显示，未经处理的SiHa细胞呈现均匀绿色荧光（正常细胞核形态），而HFP处理后，SiHa细胞出现早期凋亡特征（染色质凝缩或碎片化的绿色细胞核）和晚期凋亡特征（凝缩或碎片化的橙色染色质及凋亡小体），且凋亡细胞比例随HFP浓度的增加而升高，表明HFP通过诱导凋亡途径发挥对SiHa细胞的细胞毒性作用。

### 五、讨论与结论总结

本研究表明，从印度东南海岸Manauli岛采集的可食用红藻Halymenia floresii中分离得到的硫酸化多糖HFP具有约365 kDa的分子量，为含有葡萄糖和半乳糖残基的异质性硫酸化多糖。其较高的纤维含量增强了其益生元活性潜力，支持其在食品工业中作为功能食品的应用。HFP具有剪切变稀行为和高零剪切粘度，这是亲水胶体的典型特征，表明其具备用于营养保健品和食品工业水凝胶制剂的良好流变学性能。此外，HFP对正常细胞不具有细胞毒性，但通过凋亡途径对宫颈癌细胞系SiHa表现出细胞毒性效应。研究还发现HFP具有与肝素可比的抗凝血活性和因C2位硫酸酯取代模式导致的较低抗氧化活性。综上所述，来自Halymenia floresii的硫酸化多糖亲水胶体凭借其独特的结构和理化特性，是一种具有应用前景的生物活性聚合物，可用于制药和营养保健品领域。然而，研究结论强调，仍需进一步研究以确定硫酸酯基团的精确位置以及该多糖的具体作用机制，从而为其在制药和营养保健品领域的充分开发利用提供更深入的科学依据。