16色光谱流式细胞术抗体组合解析犬口腔恶性黑色素瘤T细胞免疫表型及免疫抑制性肿瘤微环境

《Developmental & Comparative Immunology》：A 16-colour spectral flow cytometry panel to characterise T cell immunophenotypes in canine oral melanoma

　　

16色光谱流式细胞术抗体组合用于表征犬口腔恶性黑色素瘤中的T细胞免疫表型。16色光谱流式抗体组合使犬肿瘤浸润淋巴细胞（TIL，浸润肿瘤组织的淋巴细胞）的深度免疫表型分析成为可能。犬口腔恶性黑色素瘤（COMM）呈现免疫抑制性肿瘤微环境（TME，肿瘤局部免疫与基质环境），伴有调节性T细胞（Treg，抑制免疫应答的T细胞）和耗竭T细胞（Tex，慢性抗原刺激下功能受损的T细胞）。肿瘤CD8⁺ T细胞数量较少，但表现出增强的细胞毒性潜能。程序性细胞死亡蛋白1阳性（PD-1⁺）肿瘤坏死因子受体2阳性（TNFR2⁺）T细胞界定了一个在肿瘤中富集的耗竭样亚群。

研究背景与目的：犬口腔恶性黑色素瘤（COMM，犬口腔黏膜来源的恶性黑色素瘤）侵袭性强，与人类黏膜黑色素瘤在组织病理、转移行为和免疫逃逸方面高度相似，是免疫健全动物中自发产生的比较肿瘤学模型。免疫检查点抑制剂（ICI，阻断抑制性免疫信号的抗体）等免疫治疗改变了转移性黑色素瘤治疗格局，但应答率可变、免疫相关不良反应难以预测。T细胞在抗肿瘤免疫中关键，其效应、记忆、调节和耗竭状态与肿瘤进展、免疫逃逸及治疗应答相关；然而犬肿瘤浸润淋巴细胞（TIL，浸润肿瘤组织的淋巴细胞）的异质性，包括活化、记忆、调节和耗竭状态，了解远少于人类。现有犬黑色素瘤研究多聚焦CD4⁺、CD8⁺和调节性T细胞（Treg，抑制免疫应答的T细胞）；免疫组化（IHC）有空间信息但每张切片通常限单一标志物，常规流式受激光、检测器和光谱重叠限制。光谱流式通过捕获全发射光谱和数学解混支持更大抗体组合。因此研究人员开发并验证16色光谱流式细胞术抗体组合，用于刻画COMM和其他实体瘤T细胞免疫表型，并比较肿瘤浸润、组织驻留和循环T细胞。

关键技术方法：肿瘤活检来自Utrecht University附属伴侣动物医院、Nieuwegein的Evidensia动物医院和Gouda兽医转诊中心；健康口腔黏膜来自4只因无关研究安乐死的犬；外周血单个核细胞（PBMC，外周血单个核细胞）来自健康供血犬残余buffy coat。组织经酶解制备单细胞悬液，PBMC经密度梯度离心分离；用植物血凝素（PHA）刺激PBMC 72 h；采用16色光谱流式染色、Aurora三激光光谱流式细胞仪采集、SpectroFlo解混、FlowJo手动门控和t-SNE聚类、R Studio热图及GraphPad Prism统计。

研究结果：
3.1 研究人群（Study population）：共收集10只犬的12份肿瘤样本，含口腔黑色素瘤9份、口腔肥大细胞瘤（MCT）1份、口腔外周神经鞘瘤（PNST）1份和肾上腺皮质癌（ACC）1份；7份黑色素瘤为复发，2份来自同一患犬；患犬6–15岁，男女比7:4；健康口腔黏膜来自2岁Beagle犬。
3.2 有丝分裂原刺激诱导活化和耗竭T细胞表型（Mitogen stimulation induces activated and exhausted T cell phenotypes）：5只健康供犬PBMC经PHA刺激72 h后，CD3⁺ T细胞中CD8⁺比例增加，CD4⁺和CD4^-CD8^-比例多下降；CD8⁺幼稚T细胞（TN）、CD4⁺和CD8⁺中央记忆T细胞（TCM）及CD4⁺效应记忆T细胞（TEM）下降，CD4⁺和CD8⁺终末分化效应记忆T细胞（TEMRA）增加；CD25、Ki-67、干扰素γ（IFN-γ）在T细胞亚群升高，CD8⁺细胞颗粒酶B（GzmB）升高，程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）在CD4⁺和CD8⁺升高，PD-1⁺肿瘤坏死因子受体2阳性（TNFR2⁺）细胞增加且CD4⁺更明显；t-SNE显示刺激与未刺激T细胞形成不同聚类，提示组合可捕获不同犬T细胞亚群。
3.3 实体瘤较口腔黏膜活检获得更高细胞产量和CD45⁺细胞频率（Higher cell yield and CD45⁺ cell frequency in solid tumours than in oral mucosa biopsies）：肿瘤活检（n=11）平均每克14百万细胞，口腔黏膜（n=4）平均0.5百万；肿瘤CD45⁺频率13%高于黏膜5%，但差异未达显著（p=0.0681），肿瘤样本间变异大（1.5–21%）；CD3⁺频率无差异（1.5% vs 2%）。
3.4 犬口腔恶性黑色素瘤呈现促肿瘤免疫微环境（Canine oral malignant melanoma demonstrates a protumour immune microenvironment）：COMM单细胞悬液与健康口腔黏膜和健康PBMC比较显示，TIL中CD4⁺较高、CD8⁺较低，CD4:CD8比值升高；COMM中TEM较多、TN较少，CD4⁺和CD8⁺ TEMRA较少；CD4⁺ TIL中CD25⁺FoxP3⁺ Treg比例高于循环CD4⁺ T细胞；PD-1⁺TNFR2^+/-细胞在所有TIL亚群中显著高于组织驻留或循环T细胞；COMM中CD4⁺、CD4^-CD8^-、CD8⁺和自然杀伤T细胞（NKT）表达CD25或Ki-67的比例高于血液；肿瘤浸润与循环NKT和CD8⁺ T细胞GzmB⁺比例相近，组织驻留CD8⁺ T细胞GzmB⁺较低。t-SNE确认COMM中CD25⁺FoxP3⁺ CD4⁺ Treg富集并可表达PD-1、TNFR2和Ki-67，CD8⁺ TIL频率低，TEM富集且相当比例共表达PD-1和TNFR2；PD-1⁺TNFR2⁺ TEM较PD-1^-TNFR2^- TEM上调Ki-67，CD4^-CD8^- PD-1⁺TNFR2⁺ TEM上调CD25，CD8⁺ PD-1⁺TNFR2⁺ TEM上调GzmB；TEMRA较少且少数表达PD-1而不表达TNFR2。该部分通过手动门控和t-SNE聚类得出COMM具有免疫抑制、促肿瘤TME的结论。
3.5 其他实体瘤中的TIL表型（TIL phenotype in other solid tumours）：对口腔MCT、口腔PNST和ACC单细胞悬液分析，发现相当比例TIL共表达PD-1和TNFR2；除PNST外，其他肿瘤中CD25⁺FoxP3⁺ CD4⁺ Treg频率高于健康口腔黏膜或血液；肿瘤相对血液富集TEM；CD25和Ki-67在不同肿瘤类型中变化不一。该部分说明组合可可靠捕获不同实体瘤TIL的表型和功能特征。

讨论与结论：讨论指出，广泛TIL免疫表型分析有助于理解肿瘤-免疫相互作用、发现生物标志物和免疫靶点并预测治疗结局，但犬数据远少于人；此前犬黑色素瘤最广泛组合为9色，本研究提出16色光谱流式组合。COMM中CD8⁺ T细胞和NKT细胞相对少，但CD8⁺ TIL的GzmB表达高于组织驻留而非循环CD8⁺ T细胞；Treg在COMM中相对富集，CD25⁺FoxP3⁺ TIL共表达Ki-67且CD25⁺FoxP3⁺ CD8⁺ T细胞在COMM中缺失，支持其为具有调节活性的Treg；TEM在TME富集而TEMRA较少，PD-1⁺TNFR2⁺ TEM可能反映向耗竭样表型分化；犬CD4^-CD8^- T细胞约占10–20%，高于人类肿瘤和血液的1–4%，其表型与CD4⁺ T细胞大部分重叠但CD25升高，需进一步研究其TME功能；PD-1在所有TIL亚群升高，PD-1⁺TNFR2⁺亚群在肿瘤中富集（22% vs 活化T细胞9%），提示其可能为肿瘤相关耗竭样亚群并可作为免疫治疗再激活靶点。局限性包括健康口腔黏膜样本来自少量实验犬且年龄和品种与黑色素瘤患犬不同，可能不能完全代表无黑色素瘤老年宠物犬的口腔免疫环境。研究结论翻译：总体而言，这些结果突出COMM微环境中免疫激活、免疫抑制和功能障碍之间的复杂相互作用，强调同时考虑TIL表型和功能的重要性。通过描述肿瘤浸润、组织驻留和循环淋巴细胞之间的区室差异，研究凸显免疫环境在塑造T细胞应答中的作用。尽管由于健康组织有限，多数研究比较肿瘤浸润与循环T细胞，本研究也面临从这些组织获得足够细胞的挑战，但该工作拓展了对犬肿瘤免疫学的理解，并识别出旨在恢复抗肿瘤免疫应答的潜在干预靶点。重要的是，所提出的16色光谱流式细胞术抗体组合为犬TIL的详细免疫表型分析提供了稳健工具，可进一步扩展和定制以弥合当前限制比较肿瘤学方法的知识缺口。