D(+)-莱芬糖五水合物通过上调P21表达诱导胶质母细胞瘤细胞的衰老

《Chemico-Biological Interactions》：D(+)-Raffinose Pentahydrate Induces Senescence in Glioblastoma Cells by Upregulating P21 Expression

　　

摘要

D(+)-棉子糖五水合物（RP）是一种天然来源的半乳寡糖，被发现是一种低毒性的化合物，具有显著的抗肿瘤潜力。然而，它对胶质母细胞瘤（GBM）的治疗效果尚未得到充分研究。在本研究中，我们证明了RP在体外显著降低了GBM细胞的增殖，并在体内皮下异种移植模型中抑制了肿瘤生长，尽管它无法穿过血脑屏障（BBB）。值得注意的是，RP还抑制了人类原发性胶质母细胞瘤肿瘤细胞的生长。通过全面的RNA测序分析、分子对接计算和流式细胞术，我们确定P21是RP治疗响应的重要介质，而细胞衰老是关键的细胞毒性机制。基因操作实验证实，P21缺乏会减弱RP的抑制作用，而P21过表达则会增强其抗肿瘤活性。从机制上讲，RP通过p21相关调控诱导G1细胞周期停滞，最终引发细胞衰老并对GBM发挥抗癌作用。这些发现不仅揭示了RP的抗肿瘤机制，还突显了其作为GBM治疗新药物的潜力。

引言

胶质瘤是中枢神经系统（CNS）中最常见的恶性肿瘤，占所有CNS肿瘤的30%，以及恶性脑肿瘤的80%以上[1]。其中，多形性胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的类型，占胶质瘤的60%到70%[3]。GBM的特点是高发病率、高复发率和高死亡率，同时治疗效果较差[4]。尽管包括手术、放疗和化疗在内的综合治疗策略有所进步，但GBM患者的预后仍然不佳，中位生存时间仅约为15个月[5]。欧洲多中心癌症联合治疗试验（EORTC-NCIC试验）的数据表明，即使在当前的标准治疗方案下——即放疗同时使用替莫唑胺，随后再辅助使用替莫唑胺——GBM患者的预后仍然较差，仅27.2%的患者能存活两年，9.8%的患者能存活五年[6]。

尽管替莫唑胺（TMZ）作为目前GBM的一线治疗方法，在O⁶-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（MGMT） promoter甲基化的患者中显示出一定的疗效[7]，但它仅将这一亚组的总体生存率提高到两年48.9%，五年13.8%[7]。然而，相当一部分缺乏MGMT promoter甲基化的患者没有有效的治疗选择[8]。此外，IDH1野生型这一分子亚型是胶质瘤的一个重要预后因素，通常预示着不良的预后[9]。虽然替莫唑胺在IDH1突变型胶质瘤患者中疗效更好，但IDH1野生型肿瘤患者的客观反应率仅为17%[10]。鉴于IDH1突变仅发生在6%的GBM患者中[11]，大多数患者对替莫唑胺的反应较差，这凸显了迫切需要新的、安全有效的治疗药物。

D(+)-棉子糖五水合物（RP）是一种从天然半乳寡糖棉子糖衍生而来的五水化合物[12]，是一个有希望的治疗候选物。棉子糖是RP的主要活性成分，是一种由半乳糖和葡萄糖组成的三糖[13]，在豆类、十字花科蔬菜和生姜等天然来源中含量丰富[14]。作为一种天然化合物[15]，棉子糖具有低毒性和广泛可用性的优势[16]。然而，由于其易降解和半衰期短等固有缺点，其临床应用受到限制[17]。医学化学的最新进展解决了这些问题。Bates等人[17]报告称，结晶形式的棉子糖可以以五水合物的形式存在，即棉子糖五水合物（RP），这种形式比原始化合物具有更高的稳定性、更好的长期保存性和更高的药物活性[18]。

新兴证据表明，RP在多种人类疾病中具有显著的治疗潜力[19]，包括抗过敏、抗肥胖和抗糖尿病作用，以及预防非酒精性脂质积累[14]和调节肠道微生物群[20]。RP还被证明可以抑制铜绿假单胞菌的生物膜形成[21]。此外，RP还具有显著的免疫调节和抗癌作用。Nagura等人的研究[22]发现，RP能促进抗原呈递细胞中IL-12的表达，增加CD4⁺ T细胞分泌IL-2，并上调INF-γ，从而增强免疫防御和肿瘤抑制功能。IL-12的治疗潜力在多种恶性肿瘤中已有充分证据，包括结直肠癌[23]、淋巴瘤[24]和胶质瘤[25]。尽管有这些令人鼓舞的发现，RP在中枢神经系统相关疾病（特别是GBM）中的作用和机制仍大部分未被探索。

在这项研究中，我们探讨了RP对GBM的抗癌作用及其潜在机制。体外和体内实验均显示，RP通过上调P21表达诱导G1细胞周期停滞，导致胶质母细胞瘤细胞衰老。此外，RP还抑制了人类原发性胶质母细胞瘤细胞的生长。这些发现表明RP是一种有前景的抗癌药物，对GBM治疗具有显著的治疗潜力。

章节片段

细胞培养和试剂

来自中国科学院上海细胞库的人类GBM细胞系（A172、U251和U87）在含有10% FBS（Gibco, #10099-141）和1%青霉素-链霉素溶液（Gibco, #15140-122；最终浓度：100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）的DMEM（Gibco, #8121300）中培养，培养条件为37°C和5% CO₂环境下，最多传代10次。RP（MCE, #HY-N1938，结构见补充图S1a）溶解在DMSO中。NSC 15364（MCE, #HY-108937）和

RP抑制GBM细胞的增殖

为了评估RP对GBM细胞的毒性作用，我们对接受RP处理的细胞进行了CCK-8细胞活力测定和菌落形成实验。CCK-8测定结果显示，RP的IC₅₀约为150 μM（在三种GBM细胞系中分别为：A172为174.1 μM [95% CI为165.0-183.5 μM]，U251为165.5 μM [95% CI为155.9-175.2 μM]，U87为186.3 μM [95% CI为180.2-192.6 μM]）。RP处理后，细胞活力显著下降，且这种效应与剂量呈正相关

讨论

近年来，由于天然化合物具有最小的副作用、多方面的功能性和与生物靶点的天然契合度[36]，[37]，它们在肿瘤治疗领域受到了越来越多的关注。作为天然化合物，棉子糖最早由Johnston等人于1843年从Eucalyptus glyptostroboides中分离出来[38]，并因其出色的

研究的局限性

不幸的是，与Lucchesi等人的研究[29]不同，本研究的重大局限性在于RP的BBB穿透能力较差，这极大地限制了其作为GBM这种颅内肿瘤的直接系统性应用。因此，尽管我们的研究结果支持RP的抗GBM生物活性，但目前的数据不足以支持将其立即作为常规静脉注射药物用于GBM治疗。此外，在颅内异种移植

CRediT作者贡献声明

郭宇航：方法学研究、资金获取、数据管理。张倩：方法学研究、数据管理。陈颖玉：数据可视化、方法学研究、调查、数据分析、概念化。裴永源：方法学研究、数据管理。卢向和：撰写与编辑、初稿撰写、验证、项目监督、资金获取、数据分析、概念化。戴张安：撰写与编辑、初稿撰写

本研究得到了温州医科大学第一附属医院临床研究伦理委员会的批准（批准号：YS2022-623），并获得了所有患者的书面知情同意。研究方案遵循赫尔辛基宣言的原则进行。临床试验编号：不适用。

所有动物实验均获得了温州医科大学实验动物管理中心行政委员会的批准（许可编号：WYYY-AEC-YS-2022-0382）。所有涉及动物的实验均按照国家研究委员会关于实验动物护理和使用的指南进行。研究符合ARRIVE指南以及相关的机构、国家和国际法规。

作者声明没有竞争利益。

数据声明

本研究中使用和/或分析的数据集可应要求向相应作者索取。

在准备本稿时，作者使用了ChatGPT来改进语言和可读性。使用该工具/服务后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。

这项工作得到了国家自然科学基金（编号：82301557）、CPSF博士后奖学金计划（授予编号GZB20230433）、温州市科学技术局（编号Y2020063）以及浙江省中医药科学技术项目（编号2024ZL606）的支持。

? 作者声明没有已知的可能影响本文报告工作的竞争财务利益或个人关系。

作者感谢温州中心医院的刘家辉博士提供了RP。

戴张安|陈颖玉|裴永源|郭宇航|张倩|陈梦瑜|曾波|王伟|蔡琳|卢向和

浙江省温州市温州医科大学第一附属医院神经外科，中国325000