二氧化钛纳米颗粒与UVA辐射协同诱导角质形成细胞通过G3BP1依赖性应激颗粒组装启动适应性促生存反应

《Archives of Toxicology》：Stress granule assembly drives an adaptive survival response in keratinocytes under TiO2 nanoparticles and UV irradiation

　　

纳米级加工可增强二氧化钛纳米颗粒（TiO₂ NPs）在紫外线暴露下的光催化反应活性。尽管该纳米颗粒广泛应用于化妆品和工业配方中，但决定角质形成细胞在紫外线暴露后存活命运的分子决策过程仍知之甚少。本研究证明，TiO₂ NPs与UVA辐射同时暴露可诱导显著的协同光毒性，而在相同各自剂量下单独暴露则不出现此效应。在光毒性条件下，角质形成细胞启动以G3BP1依赖性应激颗粒（SG）组装为特征的适应性反应以缓解细胞应激。机制上，该细胞保护性反应由PERK/eIF2α信号通路驱动，并受内质网介导的钙流协调。药理学抑制SG组装或G3BP1基因敲低加剧细胞死亡，表明SG形成作为细胞保护机制减轻蛋白质毒性负荷。总体而言，这些发现阐明了针对TiO₂介导光毒性的蛋白质稳态防御机制，为先进皮肤病学材料的安全设计评估提供了基础性见解。

研究背景方面，纳米技术的进步推动了工程纳米颗粒在纳米医学、农业、纺织、食品和化妆品等领域的广泛应用。在化妆品行业中，二氧化钛纳米颗粒（TiO₂ NPs）因其优异的紫外线阻隔能力而成为支柱性成分。TiO₂具有吸收275至405 nm波长光线并因高折射率有效反射其他波长光的独特双重特性，这种吸收与反射的双重性质可通过纳米级加工优化以实现紫外线防护。然而，纳米级加工在提升TiO₂颗粒反应活性的同时，也可能引发多种非预期反应，如光催化效应。欧洲消费者安全科学委员会（SCCS）和美国食品药品监督管理局（FDA）已针对化妆品中TiO₂ NPs的使用制定了严格指南，例如将其浓度限制在25%以确保消费者安全并最大化紫外线防护效果。尽管TiO₂ NPs已获官方批准并广泛应用于化妆品行业，但其总体安全性仍是未解问题。欧洲食品安全局（EFSA）近期因遗传毒性担忧重新评估后禁止将TiO₂作为食品添加剂，这再次引发了对皮肤科应用安全性的质疑。当前文献对于TiO₂ NPs是否能穿透角质层或诱导全身毒性存在相互矛盾的观点。此外，已明确TiO₂ NPs在紫外线照射下可促进活性氧（ROS）生成及后续细胞死亡，但关于皮肤细胞暴露后中间生存策略的系统研究严重匮乏。大多数研究聚焦于二元结局即细胞存活或细胞死亡，这在理解决定细胞在TiO₂ NPs-紫外线协同应激下存活或凋亡的分子决策过程方面留下了关键空白。应激颗粒（SGs）是细胞为维持稳态并确保在各种应激源如氧化应激、热休克、紫外线辐射、营养饥饿或病毒感染下存活而形成的一种策略。SGs通过液-液相分离（LLPS）现象在细胞质中形成，LLPS由蛋白质与核酸之间弱多价相互作用驱动，导致部分蛋白质转变为具有不同理化性质的相态，进而诱导无膜细胞器的形成。与正常生理条件下参与多种细胞过程的Cajal体和P体不同，SGs响应应激而快速形成，作为即时响应机制发挥作用。SGs的快速组装使细胞能够隔离翻译停滞的信使核糖核蛋白（mRNPs），这一过程调控基因表达并控制应激条件下的细胞命运。本研究系统探究了UVA照射下TiO₂ NPs细胞反应的分子机制，重点关注SGs形成作为关键生存策略。为建立稳健的分析基础，研究人员首先利用光谱暗场高光谱成像（DF-HSI）对人角质形成细胞及三维重建人皮肤模型（EpiDerm）中TiO₂ NPs的穿透性和空间分布进行了无标记鉴定。在光谱验证之后，研究人员表征了TiO₂ NPs在UVA照射下对细胞毒性的协同放大效应，并通过评估G3BP1（SG形成所必需的关键支架蛋白）鉴定了光驱动SG组装作为一种独特的蛋白质稳态反应。通过研究机制性信号级联，研究人员阐明了SG形成如何由内质网（ER）介导的胞质钙扰动所编排，该扰动作为ER腔内Ca²⁺释放后PERK/eIF2α信号轴的上游触发因素。最后，为确认这些颗粒的功能意义，研究人员通过小干扰RNA（siRNA）转染进行了G3BP1基因敲低。结果表明，SG组装受损显著削弱细胞活力和恢复能力，支持SGs在保护角质形成细胞抵抗光毒性中的关键作用。本研究为理解皮肤细胞如何利用适应性相变减轻纳米材料诱导的应激提供了机制性见解，并为皮肤病学纳米技术的安全设计开发提供了重要考量。论文发表在《Archives of Toxicology》。

在技术方法方面，研究人员主要采用了以下关键技术：利用光谱暗场高光谱成像（DF-HSI）结合k-means聚类和光谱角映射（SAM）技术对EpiDerm三维重建皮肤模型和HaCaT细胞中TiO₂ NPs进行无标记检测；通过MTT法和Calcein-AM染色评估光毒性及细胞活力；利用透射电子显微镜（TEM）观察细胞内超微结构变化；通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜检测G3BP1阳性应激颗粒及ATF4核转位；采用免疫印迹法检测p-eIF2α、eIF2α、p-4EBP1、4EBP1、PERK、ATF4、GRP78等蛋白表达；利用SUnSET法检测蛋白质合成水平；通过qRT-PCR分析PERK、PKR、GCN2和HRI的mRNA表达；采用Fluo-3流式细胞术测定胞内钙水平；通过siRNA转染敲低G3BP1；并使用多种信号通路抑制剂（ISRIB、GSK2656157、BAPTA-AM、EGTA、2-APB）进行机制验证。样本来源方面，人皮肤等效物（HSEs）采用EpiDerm?模型（EPI-200，MatTek公司），HaCaT细胞购自Cell Line Services公司。

研究结果方面，首先，通过光谱DF-HSI在三维重建人皮肤模型（EpiDerm）中无标记鉴定TiO₂ NPs的穿透性。研究人员发现TiO₂ NPs主要定位于角质层内，证实其物理穿透皮肤屏障。在EpiDerm模型中，单独TiO₂ NPs暴露表现出极小毒性，但UVA照射引起光毒性进行性增加，提示协同反应。其次，TiO₂ NPs与UVA辐射联合暴露协同放大细胞毒性。在HaCaT细胞中，TiO₂ NPs（最高200 μg/mL）或UVA照射（最高12 J/cm2）单独处理诱导的细胞毒性可忽略不计，但联合暴露导致显著的剂量依赖性细胞活力下降。Chou-Talalay法计算的联合指数（CI）值始终低于1，证实了强效协同毒性效应。第三，光驱动相分离作为对TiO₂ NPs-UVA应激适应性反应的可视化。通过TEM成像，研究人员在联合处理细胞中观察到胞质内形成直径约0.5 μm的独特无膜颗粒结构，这些结构仅局限于细胞质内而不存在于细胞核中，且在单独TiO₂ NPs暴露的细胞中未观察到。第四，鉴定G3BP1阳性应激颗粒及其在角质形成细胞翻译停滞中的作用。免疫细胞化学显示，联合暴露特异性触发G3BP1阳性聚集体的形成，在TiO₂ NPs 200 μg/mL和UVA 12 J/cm2条件下诱导最为显著。SUnSET实验表明联合暴露组新生蛋白质合成显著降低，表明SG形成与翻译抑制功能相关。第五，SG组装由PERK/eIF2α信号轴编排。免疫印迹显示联合暴露组p-eIF2α/总eIF2α比值显著升高，而p-4EBP1/总4EBP1比值维持基线水平，表明SG形成特异性由eIF2α依赖性通路介导。qRT-PCR显示仅PERK mRNA表达显著升高。PERK激活通过其磷酸化依赖性电泳迁移率变化确认。ISRIB或GSK2656157处理显著减少SG阳性细胞数量并恢复新生蛋白质合成。第六，胞质钙扰动触发早期PERK磷酸化。联合暴露组ATF4表达显著上调且呈现核转位，而GRP78未见显著变化，表明内质网腔内蛋白质毒性应激未显著诱导。Fluo-3流式细胞术显示联合暴露组荧光强度显著升高，表明胞内钙稳态被破坏。BAPTA-AM处理显著减少SG阳性细胞数量并抑制eIF2α磷酸化，同时恢复蛋白质合成。第七，ER靶向验证钙释放作为胞内失衡的主要来源。2-APB抑制ER膜上IP3R显著抑制SG组装，而BAPTA或EGTA螯合胞外钙无显著影响，表明钙稳态失衡主要源于胞内ER储存而非胞外来源。第八，通过G3BP1基因敲低损害SG组装加剧TiO₂-UVA光毒性。药理学抑制各阶段均一致降低细胞活力，其中GSK2656157处理组下降最为显著。siG3BP1转染有效沉默G3BP1表达并阻止SG形成，基因敲低使HaCaT细胞对TiO₂ NPs-UVA应激更加敏感，细胞活力进一步下降。

讨论部分总结：TiO₂ NPs广泛用于外用制剂，但调控角质形成细胞抵抗光催化应激存活的分子机制尚不完全清楚。本研究证明SGs作为适应性蛋白质稳态机制在人角质形成细胞中对抗TiO₂ NPs和UVA辐射诱导的协同光毒性。传统毒理学评估主要关注终末终点如细胞活力丧失或凋亡性细胞死亡，而本研究发现突出了协调的早期适应性反应。在TiO₂ NPs或UVA单独暴露均不引发可检测细胞毒性的条件下，联合暴露超过临界应激阈值，通过LLPS触发SG组装以维持细胞稳态。关于紫外线诱导的SG形成，既往研究报道仅UVC照射形成的SGs发挥细胞毒性作用，这与SGs保护细胞的典型角色相反，这些UVC诱导的SGs虽含有G3BP1但形成过程不由eIF2α介导。这种差异可能反映了紫外线波长和不同下游通路的差异。本研究中SG形成通过eIF2α依赖性信号启动，作为对抗急性光催化应激的适应性保护机制。关于胞质钙扰动，本研究证明参与SG形成的胞质钙水平升高由ER释放钙通过ER膜上IP3R引起，而非胞外流入。虽然ROS已知在高水平时通常引起细胞毒性，但低水平或瞬时氧化变化可作为信号线索。在补充评估中，联合暴露升高了胞内ROS并伴随钙动员和SG组装，但由于未评估氧化增加的因果贡献，ROS是否直接驱动上游钙流或PERK激活仍有待确定。关于NP诱导SG动态的细胞后果因材料性质、暴露设置和细胞类型而异，既往纳米毒理学研究显示了不同的SG调控模式。与这些内在材料效应不同，亚细胞毒性TiO₂ NPs单独处理在本研究中未损害人角质形成细胞的SG机器，SG组装选择性发生在联合光催化暴露下，通过ER介导的钙流和PERK-eIF2α通路。通过细胞活力研究及关键信号通路抑制和基因抑制证实了SGs在人皮肤细胞中经TiO₂ NPs和UVA光暴露后的细胞保护作用。药理学抑制PERK/eIF2α通路或敲低G3BP1显著降低细胞活力，支持SG组装的细胞保护作用。然而，由于GSK2656157等激酶抑制剂可影响多个下游通路，不能排除PERK信号赋予SG形成之外的额外生存功能的可能。研究结论翻译：总之，本研究通过鉴定SG组装作为人角质形成细胞在TiO₂-UVA协同应激下的关键细胞保护机制，加强了对纳米材料光毒性的机制理解。研究人员证明，虽然TiO₂ NPs和UVA辐射联合暴露破坏胞质钙稳态，但这些扰动不仅仅是细胞死亡的前兆，而是作为上游信号激活PERK/eIF2α/G3BP1信号轴，编排翻译机器的保护性LLPS。研究结果强调SG形成是对抗纳米材料诱导光毒性的必要适应性生存机制。通过将视角从被动氧化损伤转向主动蛋白质稳态重构，本研究填补了纳米毒性研究的关键空白。这些见解不仅增进了对皮肤细胞如何维持稳态对抗环境应激源的理解，也为下一代皮肤病学制剂和治疗策略的安全设计开发提供了科学基础，旨在增强细胞生存反应。