线粒体生物能量学缺陷与肥胖诱导的冠状动脉内皮功能障碍及ER应激的关联研究

《Basic Research in Cardiology》：Mitochondrial bioenergetics deficit linked to endothelial dysfunction and ER stress induced by obesity in coronary arteries

　　

肥胖（Obesity）与代谢综合征是代谢性心脏病的主要驱动因素，其特征为严重的心脏能量缺乏、结构重塑及进展为心力衰竭。尽管肥胖中的心肌线粒体功能障碍已被充分证实，但其对冠状动脉的影响仍未得到充分探索。本研究探讨高脂饮食（HFD）诱导的肥胖如何影响冠状动脉生物能量学、线粒体REDOX平衡及内皮功能。研究采用断奶后雄性Wistar大鼠喂食HFD（60% kcal来自脂肪）15–16周作为饮食诱导肥胖模型，并以衣霉素（tunicamycin）处理大鼠作为体内化学诱导内质网（ER）应激模型。研究全面开展了肌动描记实验以评估冠状动脉内皮功能、活性氧（ROS）测量以及Seahorse分析仪中的线粒体呼吸实验。HFD喂养15–16周后，大鼠出现代谢综合征特征，包括体重增加、高血糖、高甘油三酯血症及乳酸升高。冠状动脉表现出内皮功能障碍，表现为乙酰胆碱（ACh）和异丙肾上腺素诱导的舒张受损，由NADPH氧化酶1（NOX1）衍生的ROS介导，选择性NOX1抑制（NoxA1ds-tat）可恢复血管舒张。动脉中线粒体ROS（mtROS）水平升高但心肌中未升高，同时过氧化氢（H?O?）介导的信号传导得以保留。蛋白分析显示内皮NOX4和锰超氧化物歧化酶（MnSOD）下调，呼吸复合体IV（COX-IV）和解偶联蛋白2（UCP2）降低，以及基础、ATP关联和最大状态下线粒体呼吸减弱。过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α（PGC-1α）上调表明适应性生物发生。HFD还激活了内质网（ER）应激。值得注意的是，衣霉素诱导的ER应激重现了这些缺陷，损害舒张、H?O?产生和呼吸，但上调了保护性NOX4/MnSOD/PGC-1α。这些发现将冠状动脉线粒体损伤与肥胖驱动的心脏疾病相关联，强调冠状动脉生物能量学受损、线粒体氧化应激和ER应激作为关键机制。因此，冠状动脉线粒体成为改善微血管灌注和减缓肥胖向心力衰竭进展的治疗靶点。

**研究背景**：肥胖是全球范围内日益流行的公共卫生问题，显著促进代谢性和心血管疾病的发生。肥胖通过代谢、血流动力学和炎症通路的改变加速心力衰竭的进展。代谢性心脏病的特征包括左心室肥厚、舒张功能障碍和收缩力降低，与ATP产生减少和严重的心脏能量缺乏相关。线粒体损伤是多种慢性非传染性疾病（如肥胖、糖尿病、心血管疾病和癌症）中低度炎症的主要致病因素。在血管壁中，内皮细胞主要依赖无氧糖酵解进行ATP周转，内皮细胞线粒体参与钙稳态和通过释放血管舒张性mtROS进行的细胞信号传导。肥胖已被证明损害mtROS信号传导导致内皮功能障碍。然而，肥胖对冠状动脉生物能量学和内皮功能的影响，以及ER应激在冠状动脉疾病中的作用，仍待完全阐明。研究人员提出假设：肥胖减弱冠状动脉线粒体呼吸，与ER应激和内皮功能障碍相关联，可能损害代谢性心脏病中的心肌灌注。

**研究方法**：研究人员采用断奶后4周龄雄性Wistar大鼠，随机分为两组，分别喂食高脂饮食（HFD；60% kcal来自脂肪）或标准饮食（STD；3.5% kcal来自脂肪）15–16周，建立早期饮食诱导肥胖模型。另采用衣霉素腹腔注射（0.30 mg/kg，每两天一次，持续两周）建立化学诱导ER应激模型。关键技术方法包括：微血管肌动描记术评估冠状动脉内皮功能（ACh和异丙肾上腺素诱导的舒张反应）；荧光素增强化学发光法测量超氧阴离子（O?•?）产生；Amplex Red法测量H?O?生成；MitoSOX法测量线粒体ROS；Seahorse XF HS分析仪进行线粒体呼吸实验（MitoStress测试，依次注射寡霉素、FCCP和鱼藤酮/抗霉素A测定OCR和ECAR）；Western blot分析蛋白表达；免疫组化定位NOX4表达。

**研究结果**：

**HFD诱导的肥胖导致冠状动脉内皮功能障碍**：HFD大鼠在15–16周后表现出体重显著增加、轻度高血糖和高甘油三酯血症、血清乳酸升高，表明代谢综合征状态。冠状动脉对ACh的舒张反应显著减弱。选择性NOX1抑制剂NoxA1ds-tat显著改善HFD动脉的ACh诱导血管舒张，非选择性NOX1/4抑制剂GKT137831证实了该结果，表明NOX1衍生的氧化应激在HFD诱导肥胖相关的NO依赖性内皮舒张受损中起关键作用。HFD大鼠冠状动脉中NOX衍生的H?O?产生呈增加趋势，但心肌中无变化。GPx蛋白水平在HFD大鼠的冠状动脉和心肌中均显著升高。

**HFD诱导肥胖大鼠冠状动脉中线粒体氧化应激增加但H?O?介导的内皮舒张得以保留**：MitoSOX检测显示HFD大鼠冠状动脉中基础mtROS水平升高，但心肌中无变化。肥胖动物冠状动脉和心肌中基础H?O?水平与对照组无差异。线粒体抗氧化剂MitoTEMPO在STD和HFD大鼠中均增加基础张力，表明抑制了基础释放的舒张性H?O?。MitoTEMPO在STD和HFD大鼠冠状动脉中同等程度地减少ACh诱导的血管舒张，表明健康和肥胖大鼠冠状动脉中内皮衍生的血管舒张性mtROS得以保留。

**HFD诱导肥胖下调冠状动脉MnSOD和NOX4但上调PGC1α表达**：免疫组化证实内皮NOX4表达及其与eNOS的共定位。Western blot显示肥胖大鼠冠状动脉中NOX4蛋白水平降低但心肌中不变。MnSOD在HFD大鼠冠状动脉中降低，而心肌中升高。PGC1α蛋白水平在肥胖大鼠的冠状动脉和心肌中均上调。

**HFD诱导肥胖降低冠状动脉线粒体呼吸**：Seahorse分析显示HFD大鼠冠状动脉中OCR在整个生物能量学谱中显著降低，包括基础呼吸、ATP产生、质子漏、最大呼吸和非线粒体呼吸。ECAR在肥胖动物冠状动脉中也降低。COX-IV和UCP2蛋白表达在HFD大鼠冠状动脉中显著降低，而在同一动物心肌中上调。

**HFD诱导肥胖导致大鼠冠状动脉和心肌内质网应激**：冠状动脉中伴侣蛋白BiP和UPR分支磷酸化形式eIF2α和IRE1α水平在肥胖动物中显著升高。心肌中BiP和pEIF2α也上调，但pIRE1α无变化。

**ER应激诱导冠状动脉内皮功能障碍和血管收缩增强**：衣霉素处理大鼠冠状动脉中BiP、pEIF2α和pIRE1α表达增加，验证了模型。5-HT诱导的血管收缩增强，ACh和异丙肾上腺素诱导的内皮依赖性血管舒张减弱。非选择性NOX抑制剂apocynin和选择性NOX1抑制剂Nox1A ds-tat均未显著改善ER应激组的ACh诱导舒张。NADPH刺激的ROS产生在衣霉素处理大鼠冠状动脉中无差异。

**ER应激损害冠状动脉线粒体H?O?介导的内皮舒张并上调线粒体抗氧化防御和生物发生**：MitoTEMPO减少对照组冠状动脉的ACh依赖性血管舒张，但不减少衣霉素处理大鼠的。ER应激大鼠冠状动脉中MitoSOX测量的mtROS水平无差异，但H?O?水平显著降低。NOX4、MnSOD和PGC1α在ER应激动物冠状动脉中上调。NOX1/4抑制剂GKT137831抑制衣霉素处理大鼠冠状动脉的ACh诱导血管舒张，但不抑制对照组的。

**衣霉素诱导的ERS降低冠状动脉线粒体生物能量学**：与HFD肥胖大鼠类似，衣霉素处理大鼠冠状动脉中氧消耗降低，FCCP后最大OCR降低从而减少备用呼吸能力，ECAR无显著改变。线粒体呼吸减弱与COX-IV和UCP2显著上调相关联。

**讨论部分总结**：研究人员提供了肥胖影响冠状动脉生物能量学的新证据，证明HFD诱导的冠状动脉线粒体呼吸减弱与内皮功能障碍和ER应激相关联。HFD诱导的肥胖通过增强NOX1衍生ROS介导的氧化应激损害冠状动脉内皮依赖性舒张，部分由线粒体H?O?代偿。冠状动脉中NOX4和MnSOD表达降低，而PGC1α上调作为对抗线粒体氧化应激的保护性代偿反应。UCP2表达降低可能促进线粒体氧化应激和冠状动脉内皮功能障碍。HFD诱导的肥胖激活冠状动脉和心肌中UPR的不同分支。衣霉素诱导的ER应激重现了冠状动脉内皮功能障碍和线粒体呼吸减弱，但不涉及NOX衍生ROS，同时上调保护性NOX4/MnSOD/PGC-1α。两种模型之间的差异表明衣霉素诱导急性ER应激反应激活适应性代偿机制，而肥胖模型以较低但持续的慢性ER应激为特征。冠状动脉生物能量学缺陷先于心肌损伤。总体而言，这些发现揭示冠状动脉线粒体是肥胖相关代谢性心脏病的主要靶点，线粒体和ER应激汇聚损害血管生物能量学和微血管灌注，可能先于心肌适应性变化。

**研究结论翻译**：本研究证明线粒体氧化应激、生物能量学缺陷和ER应激与肥胖中的冠状动脉内皮功能障碍相关联，其机制为参与线粒体ROS产生和抗氧化防御的分子机制失衡。因此，HFD诱导的肥胖通过NOX1衍生的氧化应激损害冠状动脉内皮血管舒张，部分由线粒体H?O?代偿，同时伴有线粒体氧化应激、ER应激激活和与COX-IV及抗氧化解偶联蛋白UCP2表达降低相关的呼吸减弱。冠状动脉生物能量学缺陷先于心脏损伤，表现为肥胖大鼠心肌中COX-IV、UCP2和PGC1α的代偿性上调。ER应激独立损害冠状动脉线粒体功能和内皮血管舒张，但触发保护性抗氧化反应。总体而言，这些发现揭示冠状动脉线粒体是肥胖相关代谢性心脏病的主要靶点，线粒体和ER应激汇聚损害血管生物能量学和微血管灌注，可能先于心肌适应性变化，为减缓肥胖向心力衰竭进展提供了新的治疗靶点。