低温消融（Cryoablation）诱导的抗肿瘤免疫机制及其联合免疫治疗策略研究进展

《Holistic Integrative Oncology》：Advances in cryoablation in tumor immunotherapy

　　

低温消融（Cryoablation）因精确且无痛而成为一种有效的非侵入性肿瘤治疗方式，目前较常用于肝脏、肾脏、肺及乳腺等实体瘤。低温消融区别于其他类型放射治疗或微波消融之处在于其能以更自然的方式释放肿瘤抗原，从而激活T细胞并使其识别和攻击肿瘤细胞。因此，低温消融不仅可根除局部肿瘤，还为利用机体自身免疫系统的联合策略创造了机会。本文研究低温消融（Cryoablation）产生抗肿瘤免疫的分子机制，并讨论低温消融联合不同类型免疫治疗的最新进展，旨在寻找更新、更优的肿瘤治疗途径。低温消融（Cryoablation）因精确且无痛而成为一种有效的非侵入性肿瘤治疗方式，目前较常用于肝脏、肾脏、肺及乳腺等实体瘤。低温消融区别于其他类型放射治疗或微波消融之处在于其能以更自然的方式释放肿瘤抗原，从而激活T细胞并使其识别和攻击肿瘤细胞。因此，低温消融不仅可根除局部肿瘤，还为利用机体自身免疫系统的联合策略创造了机会。本文研究低温消融（Cryoablation）产生抗肿瘤免疫的分子机制，并讨论低温消融联合不同类型免疫治疗的最新进展，旨在寻找更新、更优的肿瘤治疗途径。

1 作用机制

低温消融（Cryoablation）技术可追溯至19世纪中期，英国外科医生James Arnott于1845年利用-24 °C冷冻盐水治疗肿瘤，开创了现代技术之先河。在Joule-Thomson效应这一物理学基本规律得到应用后，该技术获得了长足发展。该原理指出，当气体通过微小孔道从高压区流向低压区时会发生温度变化：氩气致冷、氦气致热。Cryocare手术系统即基于此原理，在消融过程中使用高压氩气冷冻肿瘤、高压氦气复温。低温消融（Cryoablation）通过即刻和延迟两种方式清除靶组织：急性损伤由细胞内外冰晶形成所致；延迟损伤则包括免疫激活和微血管栓塞。在消融中心周围的低温区域，多数细胞死亡以凋亡（apoptosis）形式发生，这是一种较细胞崩解更为有序的死亡方式。

1.1 冰晶所致的直接损伤

第一冷却阶段：组织温度降至约-20 °C时，细胞外开始形成冰晶，导致渗透压失衡，细胞内水分被吸出，细胞脱水并丧失功能，周围液体中溶质浓度逐渐升高。当温度进一步降至-40 °C或以下时，细胞内开始形成冰晶。细胞内冰晶危害尤大，可直接损伤线粒体等重要结构并导致细胞死亡。复温阶段的损伤过程仍在持续。冰晶在复温过程中发生再结晶，尤其在0 °C至-40 °C之间，其中-20 °C至-25 °C范围内变化最为显著。此时细胞内微小冰晶聚合成更大、破坏性更强的晶体。值得注意的是，再结晶产生的机械应力对细胞的损害可能比初次冷冻时冰晶形成更为严重。

1.2 微循环障碍

低温消融（Cryoablation）除冰晶形成所致直接细胞损伤外，还可破坏连接小动脉（arterioles）与小静脉（venules）的微血管，造成显著损伤。该过程包括多个步骤：冷冻过程中血管变窄、血流中断；细胞内冰晶形成损伤血管内皮细胞；复温后血流恢复时活化血小板黏附于受损内皮；随后引发连锁反应，导致局部缺血和小血栓形成，进一步加重组织坏死。

1.3 凋亡

凋亡（apoptosis）是指细胞自然、有序的死亡过程，为维持机体稳态所必需。与坏死（necrosis）这一被动性细胞死亡不同，凋亡是涉及特定基因精确激活、表达和调控的主动性过程（见图1）。

图1 低温消融原理示意图。该图展示了低温消融（Cryoablation）过程中的关键事件：冷冻损伤细胞，最终激活全身免疫系统。细胞内水分冻结导致细胞脱水（A）；复温过程中冰晶再生长（B）；细胞破裂死亡并释放肿瘤抗原（C）；抗原被树突状细胞（DCs）摄取，经MHC II及共刺激信号（CD86/CD28相互作用）呈递给T细胞，引发（D）全面抗肿瘤免疫应答。

2 低温消融诱导的免疫应答

低温消融（Cryoablation）通过两种方式抑制肿瘤：直接导致肿瘤细胞快速死亡，以及启动机体自身防御系统对肿瘤细胞的攻击。与传统治疗相比，其具有明显优势。首先，低温消融（Cryoablation）似乎能更充分、更完整地将肿瘤相关抗原释放入血。其次，其副作用较小。早期研究表明，原发肿瘤消除后免疫系统可攻击转移灶。使用小鼠MT901乳腺癌细胞的肿瘤再攻击模型显示免疫启动有效：低温消融（Cryoablation）后复发率为16%，远低于单纯手术的86%复发率。研究人员认为此种保护源于手术过程中死亡细胞分解释放的大量肿瘤特异性抗原。前列腺低温消融（Cryoablation）后血清PSA水平升高支持了这一观点，表明大量抗原释放。据认为，这些新抗原的突然出现触发了肿瘤免疫循环，产生强大的危险信号，唤醒并动员免疫系统识别和清除肿瘤。

低温消融（Cryoablation）与其广泛抗肿瘤效应之间的确切免疫通路，尤其是如何导致大量细胞死亡并增强免疫系统，仍是激烈讨论和关键的研究领域。一个主流观点来自Matzinger提出的"危险模型"（Danger Model），该模型认为机体防御系统由体内患病或濒死细胞发出的信号所激活。重要的是，低温消融（Cryoablation）所致的细胞死亡类型主要为细胞内部结构破坏，有助于将DNA、RNA和热休克蛋白（HSPs）等大量细胞成分释放至周围环境。例如，黑色素瘤低温消融（Cryoablation）后HSP70升高。因此，HSP70远不止是分子伴侣：肿瘤抗原通过MHC-I分子被有意递送至DCs进行呈递，更重要的是，它促使DCs成熟。这一双重功能使HSP70成为重要纽带，大幅增强T细胞活化并引发特异性肿瘤免疫应答。事实上，多种肿瘤低温消融（Cryoablation）后均观察到DCs成熟和抗原呈递增强。在小鼠黑色素瘤模型中，低温消融（Cryoablation）后DCs内抗原蓄积远大于RFA，提供了有启发性的比较。

活化肿瘤特异性T淋巴细胞的方向性移动由ICAM-1和CCL21等信号分子引导。研究发现，低温消融（Cryoablation）可增加肿瘤组织及其引流淋巴结内皮细胞和小静脉内CCL21和ICAM-1的含量，作为归巢信号吸引初始CD8⁺ T淋巴细胞向这些区域迁移，并增加肿瘤特异性淋巴细胞数量。

CD4⁺和CD8⁺ T细胞被认为是消融后激活的主要淋巴细胞群。由于参考文献[18,19,20]为射频消融研究，低温消融（Cryoablation）特异性T细胞活化证据取自[21,22,23,24]。采用3LL Lewis肺癌（D122）和卵清蛋白转染B16黑色素瘤（M05）细胞作为自发转移模型评估冷冻免疫治疗的抗转移效果，系统观察了肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的产生、肺重量变化和小鼠生存率。在黑色素瘤模型中，研究人员采用T细胞受体转基因OT-I CTLs的过继转移，并对CD4⁺和CD8⁺细胞进行胞内细胞因子染色以评估Th1/Th2免疫应答。结果显示，冷冻免疫治疗大幅延长生存时间、增强Th1应答、产生强效肿瘤特异性CTL活性并显著减少肺转移。重要的是，仅冷冻免疫治疗产生了效应记忆细胞，而单纯瘤内DC注射仅加速CD8⁺细胞增殖[21]。在一项结直肠癌射频消融（非低温消融）研究中，肿瘤组织内PD-1/PD-L1表达升高，尤其在CD8⁺和CD4⁺ T细胞上[25]。该观察作为机制性平行证据引用，而非低温消融直接证据。NK细胞和巨噬细胞亦有所增加[26]。此外，低温消融（Cryoablation）已被证实可导致肿瘤消退、改善NK细胞功能、减少肺转移并增加全身CD4⁺和CD8⁺ T细胞[22]。来自HCC及其他癌症的证据表明，消融治疗可能促进CD4⁺和CD8⁺ T细胞增殖，同时减少Tregs数量[23,27]。这种向更有利T细胞谱的转变（CD4⁺/CD8⁺比值升高、Tregs减少）有利于抗肿瘤并延长生存[23]。低温消融（Cryoablation）与RFA的比较显示两者均可诱导特异性T细胞应答，但低温消融（Cryoablation）激活免疫系统的能力似乎更强，因其产生更强的抗原特异性CD4⁺ T细胞应答[28]。

低温消融（Cryoablation）通过改变细胞因子含量来改变免疫系统功能，此种改变取决于个体年龄、肿瘤类型及冷冻速率[29]。消融后大量IFN-γ有助于连接ADCC与更强的Th1应答[30]。低温消融（Cryoablation）以外的热消融方式，如RFA和微波消融，与包括IL-1β、IL-6和IL-8在内的促炎细胞因子升高相关，这些因子促进Th1极化和抗原特异性T细胞活化[31,32]。这些发现作为支持性机制证据纳入，并非替代低温消融（Cryoablation）特异性数据。

低温消融（Cryoablation）增强抗肿瘤免疫，但此效应似乎为暂时性的。参考文献[33]为射频消融研究，仅作为比较性观察引用；低温消融（Cryoablation）特异性证据由[24,34]提供。在一项涉及22例肾细胞癌患者的研究中，治疗增加了CD8⁺和CD4⁺ T细胞数量及GZMA和CD11c转录本水平。反映免疫激活的CD8⁺/FOXP3比值从初始值升高并在术后三个月内持续保持升高。TCR-β库分析证实低温消融（Cryoablation）导致肿瘤中部分T细胞克隆扩增[24]。

在Lewis肺癌（LLC）小鼠模型[35]中，免疫健全C57BL/6小鼠腋下双侧皮下注射LLC细胞。肿瘤直径达5 mm时，于低温消融（Cryoablation）后2小时和2天瘤周注射脂多糖（LPS）（最多三次冻融循环）。对照小鼠仅接受瘤周LPS注射而不行低温消融（Cryoablation）。同侧低温消融（Cryoablation）联合瘤周LPS注射后，观察到对侧未消融肿瘤显著生长抑制，提示由上述免疫学变化介导的全身性"远隔效应"（abscopal effect）。

然而，大量动物研究表明低温消融（Cryoablation）可能产生免疫刺激或免疫抑制效应[13]。早期低温消融（Cryoablation）在大鼠纤维肉瘤模型中增加了肺转移风险，且在特定时间点脾脏抗肿瘤能力相对于手术切除暂时受损[36]。抗肿瘤免疫应答似乎取决于消融区域大小；单个肝结节比更大区域或多个结节引发更强的反应[37,38]。在大鼠肿瘤模型中，当治疗后残留大量坏死肿瘤组织时，低温消融（Cryoablation）能够抑制免疫应答；相反，少量冷冻组织导致的肿瘤生长较少。这意味着存在某种抗原刺激限度，过多抗原可能导致免疫抑制。总体而言，这表明低温消融（Cryoablation）后免疫系统可能受到抑制。尽管确切机制尚不清楚，凋亡/坏死比例和Tregs过度产生已被认为与消融后免疫抑制有关[13]。参考文献[39]和[40]分别为RFA和不可逆电穿孔研究，作为机制性平行证据引用而非低温消融（Cryoablation）特异性证据。无危险信号的凋亡性肿瘤死亡阻止DCs成熟和抗原呈递，如前所述。若巨噬细胞主要吞噬死亡细胞碎片，则机体防御可能更多倾向于产生抗体（体液免疫），因为巨噬细胞在向其他免疫系统组分呈递这些碎片方面不如DCs。巨噬细胞还可通过分泌IL-10或TGF-β抑制T细胞反应。未成熟DCs不能激活T细胞或产生TH1/TH2细胞因子。相反，Tregs则更为有利。

低温消融（Cryoablation）后的免疫应答是一种平衡行为，可向任一方向倾斜。免疫抑制可因Treg细胞和抑制性细胞因子增多及刺激性细胞因子减少而发生[13]。相反，坏死性细胞死亡释放强危险信号，帮助DCs生长、为肿瘤准备特异性T淋巴细胞并增强免疫系统。这种双重性意味着若消融区域以凋亡为主，可能产生更具免疫抑制性的环境。这提出了许多重要问题：获得良好治疗结果的最佳坏死/凋亡比例是多少？该比例能否被调整？在不同医学情况和环境中，全身和局部反应为何呈现促炎或抗炎？如何在不产生过度免疫抑制的情况下增强机体对肿瘤细胞的免疫力？

2.1 双重免疫调节效应：激活与抑制

低温消融（Cryoablation）诱导的免疫反应不仅开启免疫系统，还形成激活与抑制的复杂状态。细胞死亡方式——特别是坏死与凋亡的比例——也决定这一平衡。ATP和HMGB1等DAMPs通过坏死从死亡细胞释放，是重要的危险信号。它们协助DCs发育并迁移至淋巴结，在此启动针对肿瘤的特定T细胞应答，尤其是产生大量炎症的应答[21]。相反，凋亡性细胞死亡通常导致免疫耐受或沉默，缺乏此类强危险信号。巨噬细胞吞噬凋亡碎片后通常变得炎症性降低，分泌TGF-β和IL-10等细胞因子，促进CD4⁺ T细胞向免疫抑制性调节性T细胞（Tregs）或Th2表型分化，从而降低抗肿瘤免疫[13,39]。

低温消融（Cryoablation）近期因激活或增强某些免疫抑制机制而受到关注。调节性T细胞（Tregs）是消融后免疫抑制的主要介质。近期研究显示Treg数量呈动态变化，并提供了关于其激活和募集的新信息。在一项射频消融（非低温消融）研究中，消融后缺氧微环境中产生的腺苷通过A2AR激活增强Treg免疫抑制功能，此外还有促进Treg分化的经典TGF-β/Smad信号通路[39,41]。此外，Tregs产生IL-35等抑制性细胞因子，形成正反馈环路，主动抑制DC功能并募集更多MDSCs[42]。因此，Tregs既是抑制的"执行者"，又是维持抑制环境的"组织者"。消融（包括低温消融）与MDSC向肿瘤部位募集相关。然而，参考文献[40]为不可逆电穿孔研究，仅作为机制性平行证据引用。它们以不同但互补的方式抑制T细胞功能。PMN-MDSCs含有大量Arg-1，导致可用L-精氨酸减少，从而因L-精氨酸不足而减缓T细胞生长[43]。相反，M-MDSCs升高iNOS水平，导致NO过量产生，引起T细胞死亡并干扰信号传导[44]。两种亚群均产生大量ROS干扰TCR和CD28功能，使T细胞失能[45]。此外，MDSCs高表达PD-L1和VISTA等免疫检查点分子，直接抑制T细胞活性并连接固有与适应性免疫抑制[46]。此外，研究发现低温消融（Cryoablation）导致存活肿瘤细胞和抗癌免疫细胞上PD-L1等免疫检查点分子数量增加，这是逃避免疫系统识别的适应性反应[47]。此种上调为低温消融（Cryoablation）联合ICIs提供了理论依据。最后，CD4⁺辅助T细胞极化也受消融后环境显著影响。以IFN-γ产生为标志的强Th1反应支持CTL活性；但若转向Th2或Treg主导应答，抗肿瘤免疫将被逆转。

低温消融（Cryoablation）本身的技术因素可在很大程度上影响免疫系统被抑制与激活的程度，通过术式选择可引导免疫应答的"方向"。（1）冷冻速率：降温速度也很重要。快速冷冻（超过50 °C/min）导致细胞内冰晶形成，损伤细胞膜并杀死细胞，强烈释放免疫原性DAMPs。相反，缓慢冷冻主要导致细胞脱水和凋亡，无免疫原性或甚至产生免疫耐受[29,48]。（2）温度：需冷却至并维持足够低的温度（通常低于-40 °C）覆盖整个治疗区域以使全部组织死亡。不完全消融遗留部分存活肿瘤细胞，可能仍分泌TGF-β等免疫抑制因子，与激活免疫的目的相悖[49]。（3）冻融循环：反复冻融反复破坏肿瘤内微血管，形成大面积缺氧坏死区，释放更多内容物。此方法也使DAMPs（如HMGB1）的生存变得困难。重要的是，此过程过度炎症可能实际开启更强的负反馈环路，使局部抗感染能力下降[49,50]。

简言之，低温消融（Cryoablation）产生动态免疫微环境，促免疫与抗免疫力量持续博弈变化。低温消融（Cryoablation）调节免疫激活的确切机制仍在研究中。尽管其明显诱导全身性细胞死亡和免疫刺激，确切免疫学联系仍在阐明中。但那些确切的免疫学联系是什么？研究人员正尽力解开这一谜团。每一项新研究都增进了对这一复杂免疫电路的理解。净效应取决于免疫激活（主要由于DAMP-TLR信号）还是免疫抑制（更多Tregs/MDSCs和更多免疫检查点蛋白）占主导。这种复杂相互作用证明了单纯低温消融（Cryoablation）的局限性，并为联合治疗提供了坚实理论和明确方向。需仔细匹配Treg靶向治疗、MDSC功能调控剂，尤其是各种免疫检查点阻断剂。为确定联合时机，必须准确了解清除肿瘤细胞后免疫环境变化的时间规律，从而最大化治疗效果（见图2总结）。

图2 低温消融调控的免疫通路：危险模型。该图展示低温消融（Cryoablation）后两条免疫通路的激活，表明免疫系统需同时被激活和抑制。（左侧，免疫刺激）坏死性细胞死亡释放HMGB1和ATP等DAMPs及肿瘤抗原。这些DAMPs结合DCs上的PRRs，使其成熟并迁移至淋巴结。在淋巴结内，成熟DCs向初始T细胞呈递肿瘤抗原，产生并扩增肿瘤特异性CD8⁺ CTLs和Th1 CD4⁺ T细胞。随后这些效应细胞返回肿瘤部位进行靶向杀伤。（右侧，免疫抑制）凋亡占主导时，巨噬细胞吞噬凋亡碎片后变为抗炎性并分泌IL-10和TGF-β。此细胞因子环境有利于Treg和Th2分化。此外，低温消融（Cryoablation）还吸引MDSCs进入肿瘤并增加肿瘤细胞和浸润细胞上PD-L1等免疫检查点分子的表达，均主动抑制T细胞功能。免疫应答的最终走向取决于消融设置和肿瘤微环境。

3 肿瘤免疫治疗

总体而言，肿瘤免疫治疗可分为主动和被动两类。主动免疫治疗通过增强机体自身对肿瘤的防御来帮助对抗癌症。被动免疫治疗则较为直接，使用溶瘤病毒或单克隆抗体等外部物质直接靶向杀伤肿瘤细胞。

免疫检查点阻断（ICB）已成为当今肿瘤治疗的重要组成部分。PD-1和CTLA-4是通常作为"刹车"防止机体攻击自身的免疫检查点，但肿瘤常利用这些通路隐藏于免疫系统。阻断这些信号后T细胞被唤醒，恢复抗肿瘤能力[51]。靶向PD-1/PD-L1和CTLA-4的ICIs已改变多种肿瘤的治疗格局，如淋巴瘤、黑色素瘤和肺癌，并获得FDA批准[52]。这些通路对低温消融（Cryoablation）尤为重要。在一项射频消融（非低温消融）研究中，局部炎症和IFN-γ释放增加了存活肿瘤细胞上PD-L1表达，作为适应性防御机制[25]。低温消融（Cryoablation）后也有类似的PD-L1上调报道[24,53]。因此，低温消融（Cryoablation）联合抗PD-1/PD-L1治疗具有机制合理性：阻断该抑制信号可改善T细胞介导的肿瘤清除。同样，CTLA-4阻断可对抗调节性T细胞（Tregs）的抑制作用，并与低温消融（Cryoablation）带来的抗原释放协同，改善T细胞启动[51,54]。

Toll样受体（TLR）激动剂通过模拟病原体或损伤相关分子模式（PAMPs/DAMPs）触发免疫应答。以咪喹莫特为例，其为TLR7激动剂可激活TH1细胞；CpG ODN为TLR9激动剂可激活DCs并增强CTL活性[55,56]。它们也可能有助于增强低温消融（Cryoablation）引起的免疫反应，因此可与其他治疗良好配合。

过继细胞治疗（ACT）通过提取、扩增并回输患者自身免疫细胞（如T细胞、自然杀伤（NK）细胞或树突状细胞）来改善抗肿瘤免疫[57,58]。肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法对黑色素瘤新抗原尤其有效[57,59]。同时，CAR-NK细胞也显示出前景。重要的是，低温消融（Cryoablation）改善肿瘤微环境，使回输细胞在输注后存活更久、功能更好[58,60]。

肿瘤疫苗旨在使机体免疫系统针对肿瘤特异性或相关抗原（TSAs/TAAs）产生应答，但面临两大障碍：抗原选择错误和肿瘤免疫逃逸能力。另一选择为溶瘤病毒治疗，使用工程化病毒如FDA批准的用于黑色素瘤的T-VEC，可特异性靶向杀伤肿瘤细胞[61]。低温消融（Cryoablation）本身可充当一种原位疫苗。简言之，最终治疗结局在很大程度上取决于"初始条件"——由低温消融（Cryoablation）参数决定的特定细胞死亡方式。这一关键起点启动了随后整个免疫生物学事件的连锁反应。

4 低温消融联合免疫治疗

影像引导低温消融（Cryoablation）可提高靶向肿瘤和置入消融针的精确性，减少并发症、降低成本并加速康复[62]。所有局部消融方法均会在局部释放肿瘤抗原；然而其中低温消融（Cryoablation）在维持抗原结构方面产生最有利的结果[63]，特别适合与免疫治疗联合使用[63]。此外，单纯低温消融（Cryoablation）引起的免疫应答通常不足以消除整个肿瘤，因此必须与增强免疫系统抗肿瘤能力的其他治疗联合[21,63]。为增强低温消融（Cryoablation）的免疫原性，建议使用不同免疫治疗药物以改善固有免疫和特异性T淋巴细胞活性。不同药物靶向低温消融（Cryoablation）释放肿瘤细胞内容物所触发的抗原呈递级联的不同阶段，产生更强的肿瘤特异性免疫应答。临床报告表明低温消融（Cryoablation）与激素治疗、免疫治疗、化疗和放疗配合良好（见表1和表2）。

表1 低温消融联合免疫治疗临床研究汇总

表2 低温消融联合免疫治疗临床前动物研究汇总

4.1 低温消融联合免疫检查点抑制剂

在一项涉及19例早期乳腺癌患者的初步试验中，术前接受伊匹木单抗联合低温消融（Cryoablation）治疗，肿瘤内和全身均出现显著免疫应答[64]。联合组ICOS表达水平最高，与抗CTLA-4治疗效果相关，并显示CD4⁺和CD8⁺ T细胞持续增殖。在前列腺癌模型中，CTLA-4阻断联合低温消融（Cryoablation）可预防或排斥新肿瘤形成[71]。

同样，在鼠肾癌模型中，低温消融（Cryoablation）联合PD-1抑制剂较单一治疗显著减少转移并改善消融诱导的免疫应答[72]。此种协同部分归因于低温消融（Cryoablation）在肿瘤周围小环境中高效上调程序性死亡配体1（PD-L1）。其导致免疫原性肿瘤细胞死亡，释放抗原并引起炎症，表现为IFN-γ水平升高[8,24]。IFN-γ是连接固有与适应性免疫的关键环节；其激活JAK-STAT通路，导致PD-L1表达增加，尤其在应激存活肿瘤细胞和浸润免疫细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）中。因此PD-L1上调将其转化为"适应性免疫抵抗"机制[53]，肿瘤试图通过更多抑制信号使T细胞效能降低来逃避免疫攻击。从治疗角度而言，低温消融（Cryoablation）诱导的PD-L1上调为后续PD-1/PD-L1阻断创造了"理想可靶向通路"。这些抑制剂阻断新形成的免疫抑制轴，使受抑制的T细胞释放，杀伤能力改善，免疫系统可能更持久。简言之，低温消融（Cryoablation）发挥双重作用：既是肿瘤特异性免疫的"点火器"，又是揭示肿瘤免疫抑制弱点的"靶点生成器"，尤其通过增加PD-L1表达。免疫检查点抑制剂则作为"刹车释放器"对抗这一弱点。两种方法单独或联合应用在临床前模型中均产生较任一单独更强的抗肿瘤效果。参考文献[25]为RFA研究，而[71,72]为低温消融（Cryoablation）特异性临床前研究。该机制有助于了解同时使用不同药物的最佳时机（例如在治疗后PD-L1高表达时给予抑制剂），并提示哪些人群可能从这些药物中获得最大帮助（治疗后体内PD-L1高表达者）。

4.2 低温消融联合TLR激动剂

Redondo等[55]显示，TLR7激动剂咪喹莫特加入低温消融（Cryoablation）后大幅改善B16-OVA肿瘤小鼠的结果，生存率达95%，而单纯低温消融（Cryoablation）仅为30-35%。另一小鼠黑色素瘤模型显示，皂苷佐剂Quil-A和TLR9激动剂CpG共注射通过调节IL-1产生和扩增引流淋巴结中多功能T细胞池增强低温消融（Cryoablation）后抗肿瘤免疫[56]。这些发现表明低温消融（Cryoablation）联合TLR激动剂可能有益。

4.3 低温消融联合过继细胞治疗

4.3.1 树突状细胞（DC）治疗

Yin等在胶质瘤模型研究中显示，低温消融（Cryoablation）联合DC疫苗具有明显协同效应；低温消融（Cryoablation）改善DC抗原摄取和成熟，导致细胞毒性T淋巴细胞激活增加[73]。临床上，对于结直肠癌肝转移患者，低温消融（Cryoablation）联合DC-CIK（细胞因子诱导的杀伤细胞）治疗可改善患者免疫功能和生活质量，联合方法缓解率达61.76%，远高于对照组。

4.3.2 自然杀伤（NK）细胞

2017年Lin等发现，对于晚期实体瘤患者，经皮低温消融（Cryoablation）联合异体NK细胞免疫治疗优于单纯低温消融（Cryoablation）[60]。此后其他临床试验也证实了这一结果，表明此类联合以及低温消融（Cryoablation）联合DC-CIK治疗可帮助患者延长生存并显示免疫系统激活迹象[62,68,69,70,71,72,73,74,75]。此外，观察到多次输注NK细胞优于单次且不增加病情恶化[71]。此类ACT策略可行，已成为临床低温消融（Cryoablation）治疗日益重要的组成部分。

4.3.3 T细胞

在鼠乳腺癌模型中，低温消融（Cryoablation）增加了肿瘤特异性T淋巴细胞从肿瘤引流淋巴结向远处部位的转移。来自低温消融（Cryoablation）致敏小鼠的此类淋巴细胞过继转移显示肺转移发生率显著低于手术或对照组来源者[75]。

4.4 低温消融联合GM-CSF

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）已被证明通过促进树突状细胞生成和抗原呈递增强低温消融（Cryoablation）的抗肿瘤效果。在一项涉及6例晚期肾细胞癌伴肺转移患者的小型但具有启示性的初步研究中，低温消融（Cryoablation）联合雾化GM-CSF似乎增强了体液和全身细胞免疫[70]。值得注意的是，其中4例患者显示Th1细胞因子升高和肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞增殖。重要的是，此免疫应答强度与临床结局相关——这一有前景的相关性呼应了在晚期前列腺癌中的观察。这些发现在大鼠胶质瘤模型中得到证实，低温消融（Cryoablation）联合GM-CSF增加脾脏IFN-γ分泌并显著增强CD8⁺ T细胞介导的细胞毒性[76]。

4.5 低温消融联合肿瘤疫苗

肿瘤疫苗旨在通过递送肿瘤特异性抗原（TSAs）或肿瘤相关抗原（TAAs）使CD8⁺和CD4⁺ T细胞发挥作用，目标是产生广泛而持久的抗癌免疫反应，清除现有肿瘤并防止复发或转移[77]。常见类型包括全细胞疫苗、多肽疫苗和DC疫苗。2006年den Brok等[8]提出"原位DC疫苗"效应，即低温消融（Cryoablation）创建瘤内抗原储库。联合TLR9激动剂CpG成熟的瘤内DCs可有效消除小鼠局部和远处肿瘤。Floercken等在2013年I/II期临床试验[78]中发现，负载自体肿瘤细胞裂解物的DCs在肾癌患者中诱导患者特异性Th1免疫应答和T细胞增殖。此外，低温消融（Cryoablation）还可吸引大量DCs和巨噬细胞至肿瘤部位，有助于吞噬作用并可能使肿瘤微环境更利于疫苗发挥作用[24]。

4.6 低温消融参数、消融体积及联合时机的优化

证据特异性：本综述优先采用直接来源于低温消融（Cryoablation）的证据。使用射频消融（RFA）、微波消融、不可逆电穿孔或其他消融方式的研究仅用于说明共同或不同的生物学机制，并明确标识为非低温消融证据；不应将其解释为低温消融（Cryoablation）特异性数据的替代。

低温消融（Cryoablation）后的免疫结局受冻融参数、消融体积和联合时机影响。冷冻速率>50 °C/min、最低温度≤-40 °C和多次冻融循环有利于细胞内冰晶形成和免疫原性坏死/DAMP释放；缓慢冷冻和不完全消融可能促进凋亡、残留肿瘤源性TGF-β和免疫抑制[29,48,49]。消融体积也重要：单个小肝结节可能比更大或多个消融病灶引发更强的全身免疫，而过量坏死抗原负荷可能诱导耐受[37,38]。时机应基于机制：ICIs在低温消融（Cryoablation）诱导IFN-γ/PD-L1上调后具有合理性，而TLR激动剂或DC疫苗可能最适合在早期抗原呈递窗口期给予[25,51,54,55,56]。

5 展望与挑战

从研究中可知，低温消融（Cryoablation）联合全身化疗或免疫治疗——尤其是"免疫消融"（低温消融+免疫治疗）——具有很大益处。免疫治疗成为肿瘤常规治疗的一部分使人们开始思考低温消融（Cryoablation）如何影响机体自然防御。迄今为止，已尝试多种方法将低温消融（Cryoablation）与其他形式免疫治疗联合。冷冻免疫治疗的早期临床数据表明低温消融（Cryoablation）可能通过增强机体防御系统帮助预防或消除远处肿瘤部位。但需注意，此处引用的许多临床研究（包括表1和表2所列）仍处于早期阶段，多为初步研究或小规模综述，参与者数量有限。一个主要局限性是缺乏随机对照臂，难以确定哪种方案最佳。积极结果提示需要更大规模、设计更好的RCTs来验证基于低温消融（Cryoablation）的免疫治疗的疗效、最佳组合、顺序和患者入组标准。未来研究可能确定哪些免疫治疗药物和患者将从联合治疗中获益最大。确定最佳治疗顺序和时机仍是关键挑战。未来试验设计应解决免疫抑制障碍，如优化消融参数或联合靶向免疫抑制细胞群的药物。