《Planta》：AtRALF1 precursor processing in the Golgi complex involves two subtilisin-like serine proteases
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快速碱化因子（RALF）小肽广泛存在于植物界。在拟南芥中，RALF家族包含37个RALF样肽。AtRALF1是由120个氨基酸前体衍生的49个氨基酸肽，但其成熟过程所依赖的蛋白酶长期未明。研究人员通过计算机表达谱分析筛选可能参与AtRALF1前体加工的亚蛋白酶
快速碱化因子（RALF）小肽广泛存在于植物界。在拟南芥中，RALF家族包含37个RALF样肽。AtRALF1是由120个氨基酸前体衍生的49个氨基酸肽，但其成熟过程所依赖的蛋白酶长期未明。研究人员通过计算机表达谱分析筛选可能参与AtRALF1前体加工的亚蛋白酶（AtSBTs），利用T-DNA插入突变体、突变体杂交获得的F3纯合株系以及AtRALF1过表达株系，分析初生根长（PRL）与侧根原基（LRP）密度。结果显示，atsbt6.1中PRL与LRP密度均高于野生型，而atsbt5.3与野生型无差异；在35S启动子驱动AtRALF1异位表达背景下，AtSBT6.1与AtSBT5.3均参与前体加工。内源启动子条件下，AtSBT6.1是AtRALF1前体加工的主要生理转化酶；瞬时表达实验进一步表明，AtRALF1前体加工发生于高尔基体（Golgi complex）。该工作界定了AtSBT6.1作为体内AtRALF1成熟的主导亚蛋白酶，并揭示AtSBT5.3在异位高表达情境下的辅助加工角色。
研究背景与问题提出
快速碱化因子（RALF，rapid alkalinization factor）是一类分泌型小肽激素，在植物生长发育、生殖、免疫及环境响应中起重要调控作用。拟南芥RALF前体通常含N端信号肽与双碱性位点，需经分泌通路中的蛋白水解加工才能释放成熟活性肽。已有研究提示枯草杆菌样丝氨酸蛋白酶（SBT，subtilisin-like serine protease）参与部分RALF前体成熟，但AtRALF1这一49氨基酸成熟肽的内源加工酶始终未被鉴定。由于肽激素前体加工常具组织特异性与功能冗余，单一突变体往往表型微弱，导致主导蛋白酶识别困难。明确AtRALF1生理加工位点与酶学基础，是解析RALF–受体信号激活上游环节的关键空白。
研究人员以拟南芥为模型，结合生物信息学候选筛选、遗传突变体杂交与瞬时表达体系，定位AtRALF1前体加工的细胞器层级与酶源，得出：内源条件下AtSBT6.1为主导转化酶；35S异位过表达时AtSBT5.3可补充参与；加工事件发生自高尔基体而非内质网滞留阶段。
主要关键技术方法
研究首先基于拟南芥根系分化区表达数据，从56个SBT家族基因中筛选根高表达候选；利用ABRC提供的Col-0、p35S:AtRALF1过表达系及多个SBT的T-DNA插入突变体（如atsbt6.1、atsbt5.3等），通过杂交获得F3纯合株系，以初生根长、侧根原基密度为表型读数。蛋白定位与加工验证采用本氏烟瞬时表达：构建preproAtRALF1-GFP-KDEL（内质网滞留）与AtXylT35-proAtRALF1-GFP（高尔基体滞留）等融合体，配合Western免疫印迹（抗AtRALF1抗血清）与 confocal 显微镜观察；亚细胞逻辑由ER滞留对照与高尔基体靶向序列区分。
研究结果
基于根系表达谱筛选候选SBT
研究人员通过根分化区eFP表达数据选出AtSBT5.3、AtSBT1.8、AtSBT6.1等7个分泌途径高表达亚蛋白酶，半定量PCR验证其在根中转录存在，且AtRALF1过表达不改变这些SBT表达量，排除反馈调控干扰。
过表达AtRALF1的矮根表型依赖AtSBT6.1并受AtSBT5.3部分影响
将p35S:AtRALF1导入各sbt突变体，F3分析显示仅atsbt6.1与atsbt5.3背景能恢复根长与半矮化表型；其余突变体仍受抑。说明在异位高表达下，AtSBT6.1为主加工酶，AtSBT5.3具可诱导的补偿能力。
侧根密度表型解析SBT分工
以p35S:AtRALF1-mCherry为材料，atsbt6.1单突侧根原基密度接近atralf1缺失突变体；atsbt5.3单突表型近野生型，但其与atsbt6.1双突可完全逆转过表达侧根缺陷。表明内源AtRALF1信号主要经AtSBT6.1产生，而35S广域表达使表皮高表达的AtSBT5.3获得底物接触机会。
AtRALF1前体加工发生于高尔基体
预置KDEL内质网滞留的preproAtRALF1-GFP不被切割，仅见内质网网状荧光；换用AtXylT35高尔基体定位序列后，proAtRALF1-GFP在高尔基样点状结构中被加工出约32 kDa成熟带，而R69A双碱性位点突变体只积留42 kDa未加工前体。免疫印迹与定位共同将加工窗口锚定在高尔基体腔。
讨论与结论翻译
讨论指出，植物肽激素加工并非一一对应：AtSBT6.1在多种组织广泛表达，是RALF23、GLV1等已知底物的共同处理器；AtSBT5.3因表皮与侧根冠高表达，在35S强制表达场景中才显现冗余功能。高尔基体在此不仅是运输站，更是无活性前体向活性配体转化的调控节点。作者也说明，遗传表型虽强支持二者参与，但直接酶切证据仍待体外重建。
研究结论部分译文：
AtSBT6.1是AtRALF1主要的生理转化酶，而在AtRALF1异位过表达条件下AtSBT5.3可参与前体加工。该功能性分工反映了组织特异性表达、底物可及性与分泌通路动力学的差异，为RALF信号配体生物发生提供了上游酶学框架。
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