《Virologica Sinica》：Analysis of pathological changes and virus-susceptible cells in the testes following MPXV infection in a rhesus macaque model
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猴痘病毒（MPXV）是一种新兴的公共卫生威胁，越来越多的流行病学和临床证据支持其存在性传播途径，包括在精液中检测到病毒DNA。然而，MPXV在男性生殖系统中的致病机制仍不明确。研究人员采用恒河猴模型研究MPXV诱导的睾丸改变。结合批量RNA测序（bulk RN
猴痘病毒（MPXV）是一种新兴的公共卫生威胁，越来越多的流行病学和临床证据支持其存在性传播途径，包括在精液中检测到病毒DNA。然而，MPXV在男性生殖系统中的致病机制仍不明确。研究人员采用恒河猴模型研究MPXV诱导的睾丸改变。结合批量RNA测序（bulk RNA sequencing）、组织病理学分析和免疫荧光染色，研究人员表征了感染早期的睾丸病理学、病毒抗原分布及宿主反应。研究发现，MPXV未引起明显的炎症或广泛的细胞死亡，感染期间生精小管结构基本保持完整。此外，在生精小管内，支持细胞（Sertoli cells）中MPXV抗原共定位的比例高于精原细胞和精母细胞；而在间质中，血管内皮细胞和免疫细胞（包括巨噬细胞和T细胞）显示出显著的MPXV抗原检测信号，这与血液播散参与睾丸受累的潜在贡献相一致。MPXV感染与支持细胞标志物SOX9的下调及紧密连接相关蛋白的改变相关，提示支持细胞特征和血睾屏障（BTB）相关分子特征发生变化。转录组分析揭示了干扰素相关抗病毒通路和补体相关基因表达的变化，在间质和生精小管区域均检测到C1q阳性信号。此外，还观察到精子发生相关基因表达的变化，这可能反映了生精微环境的改变。总之，本研究在非人灵长类模型中提供了MPXV与睾丸相互作用的早期定量表征及多种睾丸细胞类型的细胞嗜性分析，并为理解MPXV感染相关的病理和免疫反应提供了见解。
**研究背景与意义**
猴痘病毒（Monkeypox virus，MPXV）是引起人兽共患病猴痘（Mpox，MPOX）的病原体，历史上分为Clade I和Clade II两个主要分支。2022年由Clade IIb引发的全球疫情迅速蔓延至至少118个国家，报告超过99,000例病例和60例死亡，世界卫生组织（WHO）于2023年5月宣布其为国际关注的突发公共卫生事件（PHEIC）。2024年因Clade I MPXV感染在中非地区大幅增加，WHO再次将MPOX列为PHEIC。流行病学证据表明，2022年全球疫情主要影响男男性行为者（MSM），性接触被认为是最重要的感染危险因素。Thornhill等的国际多中心研究纳入16个国家528例确诊病例，其中98%为男同性恋或双性恋男性，95%疑似通过性接触感染，32例中29例精液PCR可检测到MPXV DNA。这些发现提示MPXV可感染男性生殖道，导致精液中存在病毒并促进性传播。然而，MPXV在男性生殖器官（尤其是睾丸）中的细胞嗜性、相关病理损伤及功能改变尚待阐明。
睾丸是男性生殖系统的重要器官，主要负责精子发生和雄激素合成，其结构主要由生精小管和间质组成。生精小管内的支持细胞（Sertoli cells）不仅为生殖细胞提供营养和结构支持，还通过表达紧密连接蛋白（如ZO-1、claudins）形成血睾屏障（BTB），阻止免疫细胞和有害物质进入生精上皮，从而创造"免疫豁免"微环境。间质内含有血管、淋巴管和负责雄激素分泌的间质细胞（Leydig cells）。病毒感染睾丸细胞可直接破坏精子发生或导致精液中存在病毒，从而损害男性生育力并促进性传播。因此，阐明MPXV在睾丸组织中的靶细胞及病毒-宿主相互作用机制，对理解病毒诱导的生殖系统致病机制和制定靶向预防策略具有重要意义。
此前研究有限。2022年一项食蟹猴研究首次提供MPXV睾丸易感性的直接证据，21只动物中18只（85.7%）睾丸检测到病毒抗原，定位于睾丸间质和生精小管。体外研究显示MPXV上调人支持细胞中应激反应、炎症通路和细胞周期调控相关基因，同时抗病毒基因表达受抑。然而，体外细胞模型无法完全重现体内病毒-宿主相互作用，MPXV感染男性生殖系统尤其是睾丸的致病机制及功能后果仍不清楚。为此，研究人员利用MPXV感染的恒河猴睾丸组织，通过转录组测序分析和组织病理学检查，系统表征感染早期睾丸组织病理学改变、病毒细胞嗜性及宿主转录重编程。
**关键技术方法**
研究人员采用MPXV Clade IIb分离株（MPXV-B.1-China-C-Tan-CQ01）感染成年雄性恒河猴（Macaca mulatta，3–6岁，4.5–7.0 kg，来源为中国医学科学院实验动物研究所），于感染后5天采集睾丸样本。主要技术方法包括：苏木精-伊红（H&E）染色评估组织病理学改变；免疫荧光染色检测病毒抗原（A27、A29）与多种细胞标志物（SALL4、GKAP1、HSD3B1、SOX9、Vimentin、ZO-1、Occludin、CCNB2、CD31、CD19、CD8、CD68、CD4、CASP3、IRF3、C1q、C5b-9）的共定位；批量RNA测序（bulk RNA-seq）及DESeq2差异表达分析；MuSiC算法基于公共恒河猴睾丸单细胞RNA-seq数据集进行细胞类型解卷积；GO富集分析和GSEA分析。
**研究结果**
**恒河猴睾丸MPXV感染的转录重编程**：通过RNA-seq对急性期睾丸组织进行分析（1例对照、2例感染），样本间相关性分析显示感染组与对照组基因表达谱明显分离。采用似然比检验鉴定出816个差异表达基因（DEGs），包括413个上调和403个下调基因。上调基因包括RSPH6A、GJB5、THSD7A、CXCL14和AGTR2；下调基因包括OAS1、OAS2、CMPK2、FAM3D和CYTIP。GO富集分析显示上调基因富集于表观遗传调控相关条目（包括piRNA介导的DNA甲基化），下调基因主要富集于免疫相关通路（如病毒防御反应、免疫反应调节和先天免疫反应）。表明MPXV感染与宿主抗病毒通路抑制及piRNA相关基因网络失调相关。
**睾丸细胞群和功能分析**：内皮细胞标志基因（PECAM1、KDR、CDH5）上调；间质细胞标志基因无明显一致变化；支持细胞标志基因（CLDN11、AMH、SOX9、GATA4）普遍下调；紧密连接相关基因（CLDN1、OCLN、JAM2）呈下降趋势；精原细胞和精母细胞标志基因（SALL4、MAGEA4、TEX101、SYCP1）呈上升趋势，与GSEA分析中精子发生通路富集一致。细胞死亡通路相关基因无一致调控趋势，但坏死性凋亡相关标志物（RIPK1、RIPK3、CYLD）呈上升趋势。MuSiC解卷积提示感染后免疫细胞和上皮细胞估计比例增加、支持细胞估计比例降低。
**睾丸免疫细胞和功能分析**：多种免疫细胞标志基因上调，包括单核/巨噬细胞（CD163、CCR2）、中性粒细胞（S100A9、CSF3R）、T细胞（CD4、CD8A）、B细胞（CD19、CD79A）和树突状细胞（CLEC9A、ITGAX），NK细胞相关基因无一致变化，细胞毒性效应分子PRF1和KLRD1表达降低。GSEA显示宿主抗病毒反应通路负富集，炎症反应通路未富集，干扰素信号相关基因广泛下调，补体系统相关基因一致上调。
**组织病理学损伤和细胞嗜性**：H&E染色显示感染组未见明显结构破坏或炎症细胞浸润，生精小管基本形态 largely intact。免疫荧光显示A27和A29信号强共定位，后续以A29为代表病毒抗原标志物。SOX9阳性支持细胞数量呈下降趋势，Vimentin表达和分布无明显差异，沿生精小管基底膜的连续线性表达模式保留。OCLN和ZO-1阳性面积呈下降趋势。SALL4阳性精原细胞数量轻微下降，GKAP1阳性精母细胞数量下降，CCNB2阳性信号主要定位于生精小管外周精原细胞区域且感染后呈下降趋势。HSD3B1阳性间质细胞数量无明显差异，CD31阳性血管内皮细胞数量呈增加趋势。
**免疫细胞反应分析**：CD68阳性单核/巨噬细胞数量呈增加趋势，主要定位于生精小管管周和间质区域；CD4+和CD8+ T细胞数量呈增加趋势；CD19+ B细胞数量明显增加。C1q在感染组睾丸间质中表达呈增加趋势，生精小管内亦检测到C1q阳性信号；C5b-9阳性信号呈类似增加趋势。CASP3阳性面积无明显差异，IRF3蛋白水平无明显变化。
**MPXV抗原的细胞分布和共定位**：单细胞水平定量分析显示，SOX9阳性支持细胞中MPXV抗原阳性比例呈高于SALL4阳性精原细胞和GKAP1阳性精母细胞的趋势。间质中HSD3B1阳性间质细胞、CD31阳性血管内皮细胞、CD68阳性单核/巨噬细胞、CD4/CD8阳性T细胞和CD19阳性B细胞均可检测到MPXV抗原，且这些间质细胞群中MPXV阳性比例呈高于生精小管内生殖细胞群的趋势。CD31阳性血管内皮细胞中MPXV+/Marker+细胞密度高于所检测的免疫细胞群。荧光面积水平定量显示Vimentin和OCLN阳性区域与MPXV抗原重叠比例呈增加趋势。
**讨论与结论**
研究人员通过批量RNA-seq和多靶标免疫荧光分析，揭示了恒河猴MPXV感染后睾丸早期病理特征和分子反应模式。与既往基于患者精液分析或体外模型的研究不同，本研究采用非人灵长类模型在体内描绘MPXV睾丸细胞嗜性及相关功能改变。早期MPXV感染未引起睾丸明显结构破坏或广泛炎症浸润，生精小管整体形态基本保留。间质区血管内皮细胞、间质细胞和多种免疫细胞的MPXV阳性率呈高于生精小管内生殖细胞的趋势，提示血液播散可能参与睾丸MPXV受累。支持细胞在生精小管内呈现较高的病毒共定位比例，感染后SOX9和多种紧密连接相关蛋白表达呈下降趋势，MPXV抗原与Vimentin和OCLN等结构蛋白存在共定位，提示感染早期支持细胞特征和紧密连接相关蛋白表达可能发生改变，但未进行BTB通透性或完整性的直接功能评估。精母细胞蛋白水平数量下降而转录组显示精子发生相关基因上调，这一差异可能反映睾丸细胞组成改变或生殖细胞分化失调。补体相关基因上调和C1q、C5b-9阳性信号增加提供了补体相关反应的描述性证据，但未确立补体激活为主要致病机制。干扰素相关基因表达降低提示感染早期局部抗病毒/干扰素相关反应改变，MPXV编码的IFNα/β结合蛋白和F3L蛋白等免疫逃逸机制提供了潜在生物学背景。本研究局限性包括：样本量有限（转录组仅1例对照和2例感染），RNA-seq结果应视为探索性和假设生成性；病毒蛋白检测不能确定性区分生产性感染与抗原摄取；单一标志物不能完全排除相近细胞群的表型重叠；尚需人类临床样本验证。总之，本研究提出了MPXV急性感染睾丸受累的潜在模型：MPXV抗原主要检测于睾丸间质细胞，生精小管内亦可观察到；支持细胞与MPXV相关并表现SOX9表达和紧密连接相关蛋白改变，而生精小管整体结构和Vimentin分布基本保留；局部免疫反应与补体和干扰素相关抗病毒反应改变相关。本研究为非人灵长类模型中理解MPXV感染睾丸受累提供了实验证据，为进一步研究睾丸MPXV感染机制及其与性传播的潜在相关性提供了基础。
