寨卡病毒在三种伊蚊物种体内的感染过程中的动态变化

《Virology》：Temporal changes in Zika virus populations during infection of three Aedes mosquito species

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摘要

寨卡病毒（ZIKV）是一种由蚊子传播的黄病毒，主要通过埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Ae. albopictus）传播，尽管其他蚊种也可能是潜在的传播媒介。ZIKV的亚种在蚊子感染过程中可能会发生变化，但它们在不同蚊种间的动态变化仍不甚清楚。我们比较了实验感染了ZIKV的埃及伊蚊、白纹伊蚊以及潜在媒介日本伊蚊（Ae. japonicus）中的ZIKV亚种。通过对来自不同蚊体部位和感染阶段的混合样本进行下一代测序（next-generation sequencing）分析了病毒基因组，并利用多元分析评估了变异株的频率。我们在病毒开放阅读框中发现了333个核苷酸变异，其中包括142个非同义替换。变异频率模式与蚊种和感染阶段有显著关联，而与蚊体部位或病毒滴度没有显著关联。子集分析显示在日本伊蚊中存在与感染阶段的关联，但在埃及伊蚊和白纹伊蚊的联合数据集中未发现这种关联，不过采样时间的差异限制了跨物种的比较。三种非同义替换在多个物种中存在共性：包膜（E）蛋白中的T442I和I446T替换位于N444糖基化位点附近，以及NS5蛋白中的Q2893K替换。在白纹伊蚊和日本伊蚊中，T442I和I446T的频率在感染过程中普遍增加，而在埃及伊蚊中则 initial 时增加后在最终采样点下降。Q2893K的频率相对稳定。T442I和I446T在白纹伊蚊来源的C6/36细胞连续传代培养过程中也出现了频率上升。这些反复出现的频率增加与正选择作用一致，尽管其功能意义尚待确定。

引言

RNA病毒通常以基因异质性的群体形式存在，被称为“亚种”，因为它们的RNA依赖性RNA聚合酶缺乏纠错能力，导致基因组复制时突变率很高（Caldwell等人，2022年；Domingo和Perales，2019年）。病毒亚种由密切相关但并不完全相同的基因组组成，其组成不断受到选择压力和随机遗传瓶颈的影响（Domingo等人，2021年；Domingo和Perales，2019年）。选择压力包括宿主生理环境、免疫反应以及抗病毒药物和疫苗接种等外部干预措施，这些因素可能有利于具有适应性优势的变异株，从而促进病毒的进化（Domingo等人，2021年，2012年）。相反，遗传瓶颈可能会随机减少病毒多样性，而不偏好特定的变异株（Domingo等人，2021年）。选择压力的影响已在多种RNA病毒中得到证实。例如，在不同的抗体条件下，口蹄疫病毒的不同抗原变异株会被优先选择（Domingo和Perales，2018年；Martin和Domingo，2008年）；而丙型肝炎病毒长时间暴露于NS5A或NS5B抑制剂会促使耐药变异株的出现（Pham等人，2018年）。类似地，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的实验感染也显示了病毒变异株的选择与宿主物种相关（Bashor等人，2021年）。这些发现强调了表征病毒亚种对于理解选择压力和遗传瓶颈在病毒进化中的作用的重要性。

寨卡病毒（ZIKV；属于Orthoflavivirus zikaense物种）是一种通过蚊子传播的单正链RNA病毒，属于黄病毒科（Flaviviridae）（Pielnaa等人，2020年）。虽然ZIKV感染通常无症状或仅引起轻微发热，但可能出现严重的神经系统并发症，包括先天性寨卡综合征（导致胎儿小头症）和吉兰-巴雷综合征（Guillain–Barré syndrome）（Pielnaa等人，2020年）。该病毒最初于1947年在乌干达的一只恒河猴身上被分离出来，随后在非洲、亚洲和美洲扩散。在非洲和亚洲主要表现为散发或地方性流行后，2007年在雅普岛、2013-2014年在法属波利尼西亚、2015年在巴西发生了大规模暴发，估计有约150万人感染（Abushouk等人，2016年；Pielnaa等人，2020年）。巴西的暴发促使世界卫生组织在2016年将ZIKV相关的神经系统疾病和先天性畸形列为国际关注的公共卫生紧急事件（Heymann等人，2016年）。到2021年，已有89个国家和地区的本地蚊媒ZIKV传播被报道（“WHO. 2022年2月寨卡疫情更新”）。ZIKV包含两个主要的系统发育谱系：非洲谱系和亚洲谱系，后者包括导致近期大规模暴发的毒株（Beaver等人，2018年）。尽管ZIKV具有重要的公共卫生意义，但目前尚无批准上市的疫苗或特定的抗病毒治疗方法（Pielnaa等人，2020年）。

与其他RNA病毒类似，ZIKV在脊椎动物宿主和蚊子媒介中都以亚种的形式存在，其种群结构受到病毒复制过程中选择压力的影响（van Boheemen等人，2017年）。Murrieta等人发现，ZIKV亚种受蚊种、蚊体部位和饲养温度的影响。具体来说，28°C时埃及伊蚊（Ae. aegypti）的核苷酸多样性较高，而35°C时白纹伊蚊（Ae. albopictus）的核苷酸多样性更高。病毒多样性在蚊腿中的普遍高于在中肠中，某些变异株在不同蚊种中的富集程度也有所不同（Murrieta等人，2021年）。然而，其他蚊种（包括潜在媒介日本伊蚊）中ZIKV亚种的动态变化仍不甚清楚（Jansen等人，2018年；Uchida等人，2026年，2021年）。因此，我们假设ZIKV亚种在不同蚊种之间存在差异，尤其是在主要传播媒介和潜在媒介之间，以及不同蚊体部位之间。为了研究这一点，我们使用下一代测序技术分析了实验感染埃及伊蚊、白纹伊蚊和日本伊蚊中的ZIKV变异株频率，并评估了它们与蚊种、蚊体部位、感染阶段和病毒滴度的关联。

章节片段

病毒与细胞

蚊子来源的C6/36（Ae. albopictus）细胞和非洲绿猴肾来源的Vero（Cercopithecus aethiops）细胞在含有10%热灭活胎牛血清（FBS）以及青霉素、链霉素和两性霉素B的抗生素-抗真菌混合物（Fujifilm，大阪，日本）的最小必需培养基（MEM；Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州）中培养。C6/36细胞在28°C下培养，Vero细胞在37°C下培养。

样本制备和下一代测序质量

我们之前的研究中使用的ZIKV感染蚊子被用于表征不同Aedes蚊种中的ZIKV变异株群体（Uchida等人，2026年）。在感染实验过程中，从总共11只ZIKV感染的埃及伊蚊、14只白纹伊蚊和16只日本伊蚊个体中提取了cDNA样本，并根据蚊种、蚊体部位和感染阶段进行分组。此外，还有两种独立制备的Vero细胞繁殖的病毒株被用于

讨论

在本研究中，我们利用下一代测序技术（NGS）分析了埃及伊蚊、白纹伊蚊和日本伊蚊感染过程中的ZIKV变异株群体（亚种）。从蚊子中恢复的病毒群体与输入病毒株中的病毒群体有显著差异，表明病毒群体组成在蚊子感染过程中发生了变化。病毒变异频率模式与蚊种和感染阶段有显著关联，而与蚊体部位或病毒滴度没有显著关联

伦理批准和参与同意

本研究未涉及任何人类参与者、样本或脊椎动物。

数据

本研究生成或分析的所有数据均包含在本文及其补充信息文件中。

CRediT作者贡献声明

Kaname Miki：调查、正式分析、数据管理。Makoto Shimooka：写作——初稿、可视化、调查、正式分析、数据管理、概念构思。Leo Uchida：写作——审阅与编辑、写作——初稿、可视化、监督、资源管理、项目协调、资金获取、正式分析、数据管理、概念构思。Yasukazu Muramatsu：写作——审阅与编辑、监督、资源管理、资金获取。

未引用参考文献

簇密度指南；规范；世界卫生组织（WHO）。

利益冲突声明

作者声明他们没有可能影响本研究报告工作的财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可根据请求提供。

资金支持

本研究得到了日本学术振兴会（JSPS KAKENHI）（青年科学家项目；资助编号：JP19K16675和22K15477）的支持，并部分得到了日本医学研究开发机构（Japan Agency for Medical Research and Development）在北海道大学国际动物传染病控制研究所（Hokkaido University）的联合合作研究项目（2020年和2021年）的资助。本研究还得到了Rakuno学园休假研究计划的支持。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能影响本研究报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们要感谢长崎大学热带医学研究所病毒学系的K. Morita先生，他慷慨捐赠了针对黄病毒E蛋白的小鼠单克隆抗体并提供了技术支持。同时也要感谢Editage（www.editage.jp）提供的英语语言编辑服务。

Makoto Shimooka|Kaname Miki|Riko Sasaki|Yuki Eshita|Yasuko Orba|Yasukazu Muramatsu|Leo Uchida

北海道立大学兽医学院，日本江差市Midorimachi 582

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