《Transboundary and Emerging Diseases》：Seroprevalence and Risk Factors Analysis of Foot-and-Mouth Disease in Cattle and Buffaloes in Punjab of Pakistan: A 3ABC ELISA-Based Study
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口蹄疫（FMD）是一种重要的跨界动物疫病，可在地方性流行区造成重大经济损失。本研究旨在评估巴基斯坦旁遮普省九个畜牧生产区牛与水牛中针对口蹄疫病毒（FMDV）非结构蛋白（NSPs）抗体的血清流行率及相关动物水平和农场水平风险因素。研究人员开展了为期6个月的现场调
口蹄疫（FMD）是一种重要的跨界动物疫病，可在地方性流行区造成重大经济损失。本研究旨在评估巴基斯坦旁遮普省九个畜牧生产区牛与水牛中针对口蹄疫病毒（FMDV）非结构蛋白（NSPs）抗体的血清流行率及相关动物水平和农场水平风险因素。研究人员开展了为期6个月的现场调查，共采样576头动物（322头牛和254头水牛），并采用3ABC ELISA进行检测。该检测方法测定针对FMDV NSPs的抗体，支持DIVA（区分感染动物与免疫动物）策略，因为NSP抗体较接种纯化灭活疫苗更能反映病毒复制。然而，所采样动物的免疫史不可获得，本研究中的NSP血清阳性被视为既往FMDV暴露的指示，并承认不完全纯化疫苗中残留NSPs的可能性。总体FMDV NSPs血清阳性率为71.18%（410/576），各地区从Kasur的33.33%至Faisalabad的89.36%不等。牛的NSP血清阳性率（75.16%）高于水牛（66.14%），但差异无统计学意义（比值比[OR]=1.14，95%置信区间[CI]：0.88–1.47；p=0.3289）。雌性动物的血清阳性比值高于雄性动物（74.72% vs. 26.19%；OR=2.85，95% CI：1.46–5.58；p=0.0016），但由于性别分布高度偏斜，此结果应谨慎解读。10岁以上的动物较≤5岁动物更可能呈FMDV NSPs血清阳性（OR=1.96，95% CI：1.24–3.08；p=0.0085）。牛-羊混合种接触也与较高的NSP血清阳性率相关（90.91%；OR=2.73，95% CI：1.53–4.85；p=0.0417）。上述结果表明所采样畜群中存在显著的FMDV暴露，并强调在旁遮普省开展基于风险的监测、农场动物移动管理和加强农场生物安全对于FMD控制的必要性。
口蹄疫（FMD）是一种高度传染性的病毒性疾病，对牛和水牛等偶蹄动物造成巨大经济损失，被世界动物卫生组织（WOAH）列为强制通报疫病。FMDV属小RNA病毒科，有O、A、C、SAT 1、SAT 2、SAT 3和Asia 1七个血清型，因遗传变异性高和抗原快速漂移，疫苗开发和防控面临重大挑战。在巴基斯坦及南亚其他国家，FMD呈地方性流行，因疫苗不足、病例未确诊和动物自由流动导致疫情频繁暴发。旁遮普省作为牛和水牛养殖重镇，传统农村地区动物混合放牧现象普遍，FMD防控主要依赖灭活疫苗（本地生产的油佐剂疫苗和进口纯化疫苗）。血清学调查可评估动物群体暴露和免疫状态，3ABC ELISA通过检测非结构蛋白（NSP）抗体区分感染与免疫动物（DIVA策略），适用于地方性流行区无症状携带者识别和免疫运动评估。此前巴基斯坦研究报道O、A和Asia 1三个主要血清型循环，给疾病控制和疫苗效力带来障碍。在此背景下，研究人员在旁遮普省九个畜牧生产区开展3ABC ELISA血清学调查，评估牛和水牛FMD血清阳性率及种别、年龄、性别、接触类型和农场环境等相关风险因素，以增强该地区FMD流行病学认识并为靶向控制策略提供依据。
研究人员在Faisalabad、Okara、Bahawalpur、Bahawalnagar、Kasur、Rahim Yar Khan、Khushab、Bhakkar和Khanewal九个畜牧生产区开展为期6个月的横断面调查。采用便利抽样，纳入6月龄以上表观健康且畜主同意的牛和水牛，排除6月龄以下、病重、流行病学数据不完整及溶血或血清量不足的样本。通过统一问卷收集动物 demographics 和农场管理数据，颈静脉采血5 mL，3000 rpm离心10分钟提取血清，?20°C保存至检测。采用3ABC ELISA检测FMDV NSP抗体，以450 nm光密度（OD）读取，以百分比抑制率（PI）>50%判定为NSP抗体阳性。由于免疫记录不完整或畜主不愿提供准确信息，无法获取免疫史，NSP血清阳性被解释为既往FMDV暴露指示。统计分析使用SPSS 25.0，采用描述性统计、单因素和多因素logistic回归分析风险因素，计算OR和95% CI，以方差膨胀因子（VIF）检验多重共线性，Hosmer–Lemeshow检验评估模型拟合。研究共采样576头动物（322头牛、254头水牛）。
研究结果显示，FMDV NSPs总体血清阳性率为71.18%（410/576）。地区分布上，Faisalabad阳性率最高（89.36%），其次为Bhakkar（88.19%）和Bahawalnagar（82.35%），Kasur最低（33.33%）；地区间差异未达统计学显著（χ2=14.99，p=0.0594），但ANOVA显示各地区平均OD值差异显著（F=23.54，p<0.05）。多重共线性诊断显示主要预测变量VIF均低于5，Hosmer–Lemeshow检验表明最终logistic回归模型拟合良好（χ2=7.53；p=0.481）。
3.1 种别结果：牛NSP血清阳性率（75.16%）高于水牛（66.14%），但种别与NSP血清阳性的关联未获证实（OR=1.14，95% CI=0.88–1.47；p=0.3289）。ANOVA显示种间平均OD值差异显著（F=23.41，p<0.001），多因素回归调整年龄和性别后，水牛OD值显著高于牛（p<0.001），雄性也与较高OD值相关（p<0.001），年龄关联较弱（p=0.024），模型解释OD值变异的15.6%（R2=0.156）。
3.2 性别结果：雌性动物NSP血清阳性率（74.72%；399/534）显著高于雄性（26.19%；11/42），雌性NSP血清阳性比值显著高于雄性（OR=2.85，95% CI：1.46–5.58；p=0.0016）。性别间平均OD值差异显著（t=5.87，p<0.001），雄性均值显著高于雌性。
3.3 年龄组结果：NSP血清阳性率随年龄增长而升高，≤5岁动物阳性率最低，>5岁动物阳性率超过75%，>10岁动物最高。与≤5岁动物相比，>10岁动物NSP血清阳性可能性显著更高（OR=1.96，95% CI：1.24–3.08；p=0.0085），年龄为NSP血清阳性的重要风险因素。各年龄组平均OD值差异显著（ANOVA：F=19.03，p<0.001），Tukey事后分析显示>10岁动物OD值显著高于≤5岁动物，两个较大年龄组间无显著差异。
3.4 动物接触类型结果：不同动物接触类别间NSP血清阳性率存在差异。牛+羊同养动物阳性率最高（90.91%），其次为牛+水牛+羊+山羊（76.55%）、水牛+羊（72.04%）和水牛+山羊（70.83%），仅水牛群最低（33.33%）。牛+羊同养动物NSP血清阳性比值显著更高（OR=2.73，95% CI：1.53–4.85；p=0.0417），表明混合种饲养与FMD暴露显著相关。不同接触组平均OD值差异显著（ANOVA F=23.77，p<0.001），Tukey事后检验显示多个接触组间差异显著。Spearman秩相关（ρ=?0.222，p<0.0001）和线性回归均显示OD值随物种接触水平升高而降低的总体趋势。
3.5 农场环境结果：不同农场环境NSP血清阳性率存在差异，干热环境最高（89.36%；42/47），其次为干燥多尘环境（83.72%；36/43）和干燥环境（68.31%；332/486）。干热环境NSP血清阳性比值高于干燥多尘环境（OR=1.31），但关联无统计学意义（p=0.3673）。不同农场环境平均OD值差异显著（ANOVA F=7.62，p=0.00054）。
讨论部分指出，巴基斯坦为FMD地方性流行国，易感畜群庞大。本研究中九个畜牧生产区牛和水牛NSP抗体总体阳性率71.18%，表明所采样动物既往有显著FMDV暴露，与巴基斯坦FMD地方性流行性质及分子研究显示的FMDV持续循环和进化一致。3ABC ELISA检测病毒复制后产生的NSP抗体，可提供既往自然感染证据；巴基斯坦使用本地生产和进口灭活疫苗，纯化疫苗可支持可靠DIVA应用，但不完全纯化疫苗偶可导致NSP抗体检测阳性。由于免疫记录不完整或畜主不愿提供准确信息，无法确定自然感染和疫苗接种对NSP血清阳性的相对贡献，此为研究局限，NSP血清阳性率须结合该地区免疫实践解读。本研究总体血清阳性率远高于此前旁遮普省3ABC-ELISA研究（Nawaz等报道总体NSP血清流行率19.33%，牛23.09%、水牛16.04%），但两项研究地理覆盖、抽样设计、研究群体和地方流行病学情况不同，不应直接比较为FMD流行率随时间上升；Faisalabad在两项研究中均阳性率最高，提示该大型畜牧生产区持续高暴露压力。Ullah等报道巴基斯坦北部边境地区NSP血清流行率约67%，Khyber 46.5%、Swat 81.1%；Kabir等报道巴基斯坦-阿富汗边境地区总体阳性率35.25%，牛37%、水牛30%，并发现空间变异、畜群规模关联等。Khan等报道Quetta、Balochistan牛和水牛FMDV活跃循环，Landhi奶牛场研究也显示FMD显著流行病学和经济影响，故旁遮普省高NSP阳性应置于全国FMDV持续循环背景下看待。当前估计与既往旁遮普估计的差距可能源于动物接触网络和畜牧生产系统变化，高度互联的牲畜市场、奶牛场、繁殖设施和农村生产系统可促使感染或既往暴露动物跨地移动；Ali等暴发调查认为免疫状态不明动物引入、缺乏定期免疫、动物经纪人访问、邻近其他养殖场和大畜群规模是重要风险因素。
4.1 地理变异：九个研究区存在显著地理变异，Faisalabad、Bhakkar和Bahawalnagar阳性率高，Kasur很低；地区间总体关联未达统计学显著，但变异幅度具有流行病学意义。Nawaz等此前旁遮普研究也发现NSP血清阳性率显著地理变异，Faisalabad显著高于Khanewal和Chakwal。Faisalabad反复被确定为高暴露区，可能通过当地畜牧生产和牲畜移动维持传播。地理变异不太可能仅由宿主易感性差异所致，而可能归因于牲畜密度、畜群连通性、动物移动、生产系统和/或市场接触差异。Ali等暴发调查为地理异质性提供重要解释：邻近其他养殖场与FMD暴发较高比值相关，新动物引入和动物经纪人接触也是重要风险因素。高NSP阳性区可能具有较高牲畜贸易强度和农场-动物市场连通性，地区变异可反映病毒引入和传播机会差异而非内在易感性差异。Ullah等报道北部边境七个子区域NSP血清流行率从Khyber 46.5%至Swat 81.1%显著不同；Kabir等报道巴基斯坦-阿富汗边境地区结构蛋白和NSP血清流行率大幅变异，表明FMDV暴露可能性更多取决于当地流行病学情况而非国家行政区划，如牲畜密度、动物移动、畜群结构、养殖系统和疫苗可及性。Klein等Landhi奶牛场研究显示高度连通生产系统中大量水牛高度集中为FMD持续存在提供有利条件，Farooq等显示同一生产系统FMD显著经济影响。印度73项FMD研究系统综述和荟萃分析估计合并流行率43%（约50万样本），牛高于水牛（45% vs. 30%），各邦地理变异显著；Peng等全球猪FMDV系统综述和荟萃分析进一步揭示FMD仍存在显著地理变异，证实FMD持续且异质的全球负担。Rahman等孟加拉国牛和水牛FMD病例时空分析显示病例地理非均匀分布并可识别部分风险因素。FMD在地方性流行系统中空间变异常见，传播并非均匀分布，而取决于牲畜密度、动物移动、畜群连通性、饲养系统和免疫覆盖率等因素。
4.2 牛与水牛：本研究NSP血清阳性率牛高于水牛，但未达统计学显著（OR=1.14，95% CI=0.88–1.47；p=0.3289）。关联方向与旁遮普省既往研究一致：Nawaz等报道水牛NSP流行率23.09%、牛16.04%，另一项Faisalabad研究显示水牛20.75%、牛40.0%；巴基斯坦-阿富汗边境研究显示牛NSP阳性率高于水牛（37% vs. 30%）。但并非所有巴基斯坦生产系统均如此：Islamabad附近城郊奶牛场636头大反刍动物NSP血清流行率46%，水牛显著高于牛，该群体水牛比例高、多为成年雌性。这一看似矛盾的发现具有流行病学意义，表明FMDV暴露差异可能受生产系统和动物管理很大影响，而非仅由易感性差异决定。本研究纳入九个县不同畜牧系统牛和水牛，而Islamabad研究以城郊奶牛水牛为主；动物行为、畜群结构、年龄分布、生产目的、饲养密度和接触差异可导致种间暴露不同。本研究中牛较高血清阳性可能部分因牛有更多移动机会，如繁殖、奶牛经营、购买和销售；但水牛仍是巴基斯坦重要流行病学宿主，Landhi奶牛场等水牛为主奶牛系统报道FMD持续高水平传播和重大生产损失。因此，本研究中水牛NSP阳性较低并非水牛流行病学重要性有限的证据，而是提示牛和水牛相对暴露可能随当地生产和接触网络而异，建议旁遮普省FMD控制规划应同时针对两个物种。
4.3 性别差异：雌性动物血清阳性显著高于雄性。部分地方性流行区报道类似FMD血清阳性性别差异，但并非所有地理区域一致，故生物学解释须谨慎。可能原因为本研究牲畜样本构成：大多数采样动物为雌性，反映研究区奶牛生产重要性；雌性奶牛因产奶和繁殖饲养时间更长，雄性可在较年轻时出售或移动，意味着雌性在整个生产生命周期中有更多FMDV暴露机会。巴基斯坦研究也显示动物人口学和管理特征重要：Nawaz等旁遮普研究显示年龄、物种和畜群类型与FMD血清阳性显著相关，性别和妊娠不相关；Farooq等Islamabad附近城郊奶牛场也未发现性别与NSP血清阳性显著关联。这一差异值得注意，提示本研究中强性别关联可能反映群体抽样结构而非性别间生物学易感性差异。本研究性别分布高度偏斜（534雌性对42雄性），因主要在奶牛生产系统开展、雌性优先用于产奶，解读OR时应考虑此点；该不平衡可能降低性别比较准确性并引入抽样偏倚。进一步研究应在年龄、生产用途、物种和管理系统之外纳入性别，检验性别是否仍独立与FMDV暴露相关。
4.4 血清阳性与年龄：年龄相关流行病学模式更明显。>5岁动物与年轻动物NSP阳性率显著不同，>10岁动物NSP血清阳性比值显著更高。此观察生物学上合理，因NSP抗体反映既往FMDV暴露，年龄较大动物有更多时间暴露于病毒。但应强调年龄关联更可能是累积暴露的度量，而非提示老年动物本身更易感；在地方性流行生产系统中，动物接触感染动物、污染环境、公共放牧区或牲畜市场，饲养时间越长接触感染动物机会越多。此前旁遮普3ABC-ELISA研究也发现年龄为显著风险因素，支持此解释。年龄梯度对监测实践有启示：经历多个生产周期的老年动物（如繁殖和奶牛动物）有助于评估历史FMDV循环；预防措施也应确保年轻动物受到保护，因为易感年轻畜群在群体免疫不足时可参与传播。本研究年龄相关增加与地方性流行区既往研究一致：乌干达Dhikusooka等显示牛群FMDV持续循环并发现年龄相关流行病学差异；Rodríguez-Habibe等强调感染FMDV动物免疫系统可能因既往暴露和感染史而与其他年龄组不同，为年龄组间累积血清学差异提供生物学基础。
4.5 物种混合与FMDV传播：本研究最相关流行病学关联之一是混合种饲养与NSP阳性。牛和羊同养动物血清阳性率最高，仅水牛饲养最低；牛和羊同养动物NSP血清阳性可能性显著更高。此生物学上合理，因FMDV宿主范围广，不同牲畜物种可在疾病传播中发挥不同作用。巴基斯坦直接检验该风险因素的牛-羊混合研究较少，但当地流行病学证据强调畜群间和种间连通性重要性。FMDV宿主范围广，羊和山羊是旁遮普省畜牧生产系统重要组成部分；此前旁遮普省羊和山羊3ABC-ELISA调查报道总体血清流行率21%并存在显著地区变异；Ali等也显示牲畜移动、引入免疫状态不明动物、动物经纪人访问和养殖场邻近是旁遮普省FMD暴发显著风险因素。混合种系统中较高阳性比例可能反映种间传播机会增加，而非混合种系统特定生物学效应。此解释与Paton等观点一致，即理解FMDV传播应从个体动物和畜群到更大牲畜接触网络多尺度开展；混合种管理应视为FMDV传播涉及的更广泛动物接触网络的一部分。Stenfeldt和Arzt讨论FMDV传播复杂性和携带状态持续不确定性；小反刍动物尤其重要，因其可能不像牛那样快速出现临床症状，使感染动物未被发现地通过牲畜网络移动。Bolortsetseg等显示多物种血清监测在牲畜-野生动物交界群体检测FMDV暴露的潜在益处，Mkama等报道坦桑尼亚牲畜-野生动物交界FMDV暴露，Ploquin等最近显示多物种牲畜系统可能出现复杂传播模式，尤其当家畜面临野生动物传播风险时。
4.6 血清学反应性与环境因素：研究人员计算不同环境类别均值并发现差异，但环境类别与NSP血清阳性间无统计学显著相关，结果应谨慎解读。当地证据提示环境和季节因素可能影响FMD发生：Khan等检测Khyber Pakhtunkhwa农村地区2511份牛和水牛血清样本，FMD血清流行率显著季节性，并提示养殖系统、牲畜移动和气象条件为潜在影响因素。这与本研究地理环境、气候条件、采样持续时间和环境暴露分类不同有关。本研究宽泛类别如“干燥”“干燥多尘”“干燥炎热”可能未反映温度、湿度、饲养密度、通风、卫生、共享水源或动物移动的定量差异。环境因素可能通过改变动物聚集和管理及接触模式间接影响，而非直接作用于FMDV暴露。未来研究应收集饲养密度、农场卫生、共享水源、牲畜流动性、牲畜市场可及性和免疫覆盖率的定量数据，以检验控制这些潜在混杂因素后环境因素是否仍重要。
4.7 免疫与疾病控制：基于本研究观察到的流行病学模式，动物和群体水平因素维持旁遮普省FMDV暴露：年龄似与累积暴露相关，混合种饲养提供更多种间传播机会，地理异质性反映牲畜连通性和管理差异。本研究总体结论与Paton等提出的FMD控制一般原则一致，即有效控制需整合监测、免疫、移动管理和适当暴发应对；Paton等也强调FMDV传播发生在多个流行病学尺度，单一干预不太可能有效控制。当地证据尤为重要：Ali等确定旁遮普省FMD暴发风险因素包括免疫不规律、引入免疫状态不明动物、动物经纪人访问、养殖场邻近和畜群规模；Farooq等报道巴基斯坦重要奶牛系统FMD重大经济损失。这表明免疫应与移动限制、新引入动物隔离、免疫状态检查和农场生物安全结合。近期FMD免疫研究显示通过调节宿主免疫反应增强疫苗诱导保护的空间：Kim等显示D-半乳糖-D-甘露聚糖作为黏膜刺激剂可改善FMD疫苗全身免疫反应；虽不能直接从当前横断面血清学调查外推，但为未来FMD控制规划提供重要视角。除足够免疫覆盖、监测、移动控制、隔离和农场水平生物安全外，在旁遮普等地方性流行区增强疫苗诱导免疫可能提供更全面减少FMD传播策略。巴基斯坦分子数据进一步提示持续监测必要性：Jamal等报道O/ME-SA/Ind-2001e亚系在巴基斯坦存在，以及2012–2021年新O血清型亚系出现。理想情况下，NSP血清学流行病学监测应辅以分子监测，以识别不同生产系统循环病毒和选择疫苗株。实践层面，本研究结果提示应继续免疫、引入动物前检查免疫状态、新引入动物隔离、改善农场生物安全、管理牲畜移动，并在高暴露县加强监测。
4.8 局限性与解释：本研究局限为缺乏可靠免疫史。3ABC ELISA可检测既往暴露动物，但结果须结合疫苗纯度和免疫史解读；观察到的血清阳性应解释为高既往暴露证据，而非活动性感染流行率估计。便利抽样的另一局限是观察流行率不能外推至旁遮普省全部牛和水牛群体；尽管如此，研究纳入9个重要畜牧生产县并评估多个动物和农场水平因素，提供有用流行病学证据。研究结果与巴基斯坦其他少数研究一致，也强调地理变异、牛和水牛差异及年龄相关暴露，故具有相关性。总体而言，与巴基斯坦文献比较显示研究间无矛盾，表面差异并非总是矛盾，反而强调巴基斯坦FMD流行病学多样性。观察血清流行率可受研究设计、诊断方法、动物人口学、地理环境、牲畜密度、生产系统和动物移动模式及免疫状态等因素显著影响。本研究与巴基斯坦既往研究一致，显示FMDV NSP血清阳性率年龄依赖并地理变异，而其他生产系统报道不同物种和性别暴露，表明FMDV NSP血清阳性率高度依赖背景；解读血清学估计和制定区域控制规划时应考虑此因素。总体而言，本研究为巴基斯坦FMD暴发和分子数据文献贡献多地区血清学数据；高NSP阳性率、地理异质性、血清阳性率随年龄增加、牛较高阳性率及与混合种饲养系统关联，提示旁遮普省互联牲畜群体中高水平历史FMDV暴露。这些结果表明基于风险的FMD控制方法重要，包括免疫、动物移动管理、隔离、农场生物安全和持续流行病学与分子监测。
结论部分译述：本研究呈现旁遮普省巴基斯坦FMDV分布的重要流行病学发现。研究表明，动物年龄较大、雌性动物和牛群体比例较大导致FMDV NSP血清流行率升高，突出需要特定预防措施的关键风险因素。农场混合不同物种及生物安全措施薄弱使疾病发展更严重，需要改进控制策略。实施稳健生物安全措施并结合免疫规划具有降低巴基斯坦FMD发生的强大潜力。
