ZmPHO2介导的磷稳态调控玉米PAMP触发免疫与抗病性

《Plant Biotechnology Journal》：ZmPHO2-Mediated Phosphorus Homeostasis Modulates PAMP-Triggered Immunity and Disease Resistance in Maize

　　

玉米生产同时受到大量营养驱动的生长以及对各种非生物和生物胁迫抗性的影响。尽管磷（P）对玉米生长和生产力至关重要，但其在玉米免疫中的作用仍不清楚。研究人员在此表征了一个玉米病斑拟态突变体les33，该突变体表现出对南方玉米锈病（SCR）和Curvularia叶斑病（CLS）的抗性增强。图位克隆表明，编码参与P稳态的E2泛素结合酶（E2 ubiquitin-conjugating enzyme）的ZmPHO2是致病基因。在les33中，P水平升高伴随着防御相关基因表达的上调以及苯丙氨酸来源的水杨酸（SA）、木质素和类黄酮的积累增加，从而建立了P状态与免疫激活之间的遗传联系。同样，外源磷酸盐（Pi）处理在水培系统中激活防御相关基因表达并增强对SCR和CLS的抗性。特别是，flg22触发的防御标记基因表达、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化以及活性氧（ROS）的爆发均因Pi处理而增强，表明P在增强PAMP触发免疫（PTI）中发挥积极作用。此外，田间试验表明Pi肥料以Pi剂量依赖的方式改善SCR抗性，进一步支持P在玉米免疫中的关键作用。综上所述，该研究提供了P启动防御反应的遗传学和农学证据，并强调优化Pi施肥是协调玉米生产中生长与免疫的实用策略。

磷（P）是植物必需的大量营养元素，作为腺苷三磷酸（ATP）、核酸和磷脂等关键有机化合物的结构组分，在能量传递、遗传信息存储和膜完整性中发挥核心作用。已有大量基因调控植物对磷酸盐（Pi）的吸收，其中主效转录因子PHR1在缺磷条件下激活Pi吸收相关基因表达，而PHO2编码泛素结合E2酶，通过促进Pi转运蛋白如PT2和PHO1的降解负向调控Pi吸收，维持P稳态。然而，尽管大量研究聚焦于P对玉米生长和产量的遗传、生理及生化效应，P在玉米免疫中的研究仍十分有限。玉米生产既受大量营养驱动生长的影响，又受多种非生物和生物胁迫的影响，作为重要粮食和饲料作物，玉米持续受到南方玉米锈病（SCR）、Curvularia叶斑病（CLS）和南方叶枯病（SLB）等多种病害威胁，但目前仅鉴定出少数具有多病害抗性的基因，对不同类型病害抗性背后的机制仍不清楚。更为关键的是，低P地区与SCR高发区高度重叠，暗示P状况可能与玉米免疫存在关联，但P作为营养元素和防御反应触发因子的双重角色在玉米中的协调机制尚缺乏遗传学和生物化学证据。在此背景下，开展P调控玉米免疫的研究对于揭示养分-免疫互作机制及保障玉米安全生产具有重要意义。

研究人员基于玉米病斑拟态突变体les33展开系统研究。该突变体从Maize Genetics Cooperation Stock Center获得，研究人员通过图位克隆鉴定到ZmPHO2是致病基因，发现ZmPHO2功能缺失突变导致Pi吸收增加，同时增强玉米对SCR和CLS的抗性。进一步结合水培处理实验和田间施用Pi肥料试验，证实P以剂量依赖的方式正向激活玉米免疫反应，且该作用通过增强PTI相关反应实现而非直接抑制病原菌生长。该研究建立了P状态与玉米免疫激活之间的遗传联系，论文发表在《Plant Biotechnology Journal》上，为通过营养管理协调玉米生长与免疫提供了理论依据和实用策略。

研究人员综合运用了多项关键技术方法。首先通过图位克隆策略，利用混池分离RNA测序（BSR-seq）分析和基于1068株F₂重组植株的精细定位鉴定目标基因；通过转录组测序（RNA-seq）和水培处理下的差异表达基因（DEGs）分析解析分子机制；采用超高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱（UPLC-ESI-MS/MS）代谢组分析鉴定差异积累代谢物（DAMs）；利用3,3-二氨基联苯胺（DAB）染色检测H₂O₂积累；通过水培系统施加不同浓度NaH₂PO₄进行剂量效应验证；在田间采用过磷酸钙根施和叶面喷施试验评估Pi肥效果，试验采用郑单958和先玉335两个主栽杂交种，在郑州和三亚两地实施；借助逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测PTI标记基因表达；运用基于鲁米诺的化学发光法检测flg22诱导的活性氧（ROS）爆发；通过免疫印迹分析检测丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化水平；采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和气相色谱-质谱（GC-MS）分别定量水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、脱落酸（ABA）和木质素单体含量；利用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定植株P含量。样本队列方面，les33突变体（stf*-N235B）购自Maize Genetics Cooperation Stock Center，等位突变体Zmpho2-4和Zmpho2-5来自Chinese Maize EMS Mutant Database。

2.1 les33突变体表现出病斑叶片以及对南方玉米锈病和Curvularia叶斑病的抗性增强

研究人员从Maize Genetics Cooperation Stock Center获得病斑拟态突变体les33，田间种植约5周后该突变体叶尖开始自发出现黄化病斑。DAB染色显示les33中H₂O₂积累较野生型（WT）更多，表明免疫反应被激活。进一步抗性鉴定表明，les33对由Puccinia polysora引起的SCR和由Curvularia lunata引起的CLS表现出显著增强的抗性，具体表现为真菌菌落减少、真菌DNA含量降低和病情评分降低，但对由Bipolaris maydis引起的SLB抗性无显著差异。同时，les33植株表现出株高降低、SPAD值（叶绿素含量指标）下降和生物量减少等生长受损表型，且该表型在B73和Mo17遗传背景下连续回交八代后保持稳定。

2.2 ZmPHO2突变是les33病斑拟态表型和抗性增强的原因

研究人员将les33与玉米郑58自交系杂交构建F₂群体，病斑表型与正常表型以约3:1比例分离，表明该表型由隐性单基因控制。通过BSR-seq分析将致病位点定位于第6号染色体末端，进一步利用1068株F₂突变植株进行精细定位，将LES33基因锁定在38-kb区间。测序分析发现该区间内仅有Zm00001eb295490编码区存在1-bp缺失，导致移码突变。该基因编码PHOSPHATE 2（ZmPHO2），即一个参与Pi吸收负调控的E2泛素结合酶。等位性测试证实，EMS诱变的Zmpho2-4和Zmpho2-5突变体（均携带提前终止密码子）与les33杂交的F₁代表现出与les33相同的病斑拟态表型和增强的SCR及CLS抗性，从而确认ZmPHO2功能缺失突变是les33病斑拟态表型和抗性增强的原因。

2.3 les33、Zmpho2-4和Zmpho2-5突变体中P积累增加

鉴于ZmPHO2在Pi吸收中的负调控作用，研究人员假设三个突变体同源植株会积累过量P。将叶片按坏死程度分为顶部、中部和基部三部分分别测定P含量，结果显示突变体叶片各部分P含量均显著高于WT，且顶部积累最多。水培实验进一步证实，在0 mM（缺磷）、0.25 mM（正常）和2.5 mM（高磷）NaH₂PO₄条件下，les33幼苗在正常和高磷条件下均表现明显病斑且P含量显著高于WT，而在缺磷条件下无明显病斑。这些结果证明ZmPHO2突变增强了Pi吸收能力。

2.4 转录组和代谢组分析揭示les33中SA、木质素和类黄酮生物合成激活

为解析les33触发免疫的潜在机制，研究人员进行了转录组分析，鉴定到1539个上调和689个下调的DEGs。基因本体论（GO）分析显示，Pi转运相关通路在DEGs中显著富集，同时防御反应、超敏反应、系统获得性抗性、次生代谢、激素信号转导和ROS相关基因也显著富集。下调DEGs主要富集于光合作用、碳水化合物代谢和植物发育过程，表明P过积累可能通过抑制生长相关基因表达来抑制植物生长。代谢组分析共检测到284个上调和133个下调的DAMs，主要包括类黄酮、生物碱、氨基酸、酚酸等。与苯丙烷和类黄酮生物合成基因上调一致，苯丙氨酸、ρ-香豆酰莽草酸、柚皮素查尔酮、柚皮素、圣草酚等代谢物在les33中积累更高，其中柚皮素增加255倍。此外，S-木质素（而非G-木质素）增加近2倍，SA（而非JA）增加4倍，ABA含量也增加近2倍。

2.5 P以剂量依赖方式激活玉米免疫反应

为探究P与玉米抗性的关系，研究人员在水培条件下用0.005、0.25和2.5 mM NaH₂PO₄处理B73玉米。RNA-seq分析显示两组比较中DEGs显著富集于Pi转运和代谢通路及防御相关基因，且次生代谢相关GO条目在Group 1（0.25 mM vs 0.005 mM）中的显著性在Group 2（2.5 mM vs 0.005 mM）中进一步增强，呈现剂量依赖模式。抗病性鉴定表明，随Pi供应增加，B73对SCR的抗性显著增强，具体表现为离子渗漏减少和P. polysora DNA含量降低；在抗病自交系K22（携带核苷酸结合富亮氨酸重复序列受体NLR基因RppK）中，最低Pi处理显著降低抗性。对于半生物营养型病原C. lunata，高Pi处理也增强抗性，0.005 mM Pi条件下离子渗漏和真菌DNA含量均最高。等量Na⁺对照（NaCl和Na₂SO₄）处理不影响抗性。体外培养试验显示Pi对C. lunata菌丝生长和孢子数量无显著影响，说明P通过激活防御反应而非直接抑制病原菌生长来增强抗病性。

2.6 P以剂量依赖方式正向增强PTI相关反应

鉴于K22在低Pi条件下抗性降低，研究人员推测PTI可能受损。RT-qPCR分析显示，在无flg22处理时，ZmWRKY基因随Pi处理显著上调，但ZmBAK1和ZmCPK17无显著变化；而在flg22处理后，这些PTI标记基因随Pi供应增加均显著上调，表明P对玉米完整PTI反应能力的关键作用。ROS检测显示les33和Zmpho2-4突变体在flg22处理后较WT表现更强的ROS爆发，B73中flg22诱导的ROS爆发随Pi供应增加而增强。MAPK磷酸化分析显示les33和Zmpho2-4中MAPK磷酸化信号更强，高Pi处理的B73中MAPK磷酸化也以剂量依赖方式增强。

2.7 外源磷施用增强田间SCR抗性

田间试验在郑州和三亚两地以郑单958和先玉335为材料，在50天后以0、45、90、180和360 kg/ha P的终施用量施用过磷酸钙。结果表明，与对照相比，两个杂交种在施用90 kg/ha或更高剂量Pi时病情评分显著降低；叶面喷施也产生类似效果。值得注意的是，在郑州仅45 kg/ha Pi即可显著增强抗性，而在三亚则无显著差异，原因是郑州土壤P含量比三亚高约35 mg/kg。这些结果证明P在增强玉米免疫中的重要作用，特别是在低P土壤地区。

讨论部分围绕四个层面系统阐述了研究意义。研究人员指出，P增强玉米对生物营养型病原P. polysora和半生物营养型病原C. lunata的抗性，但对坏死营养型病原B. maydis无显著抗性。高P积累突变体les33中SA显著升高而JA不变，表明P可能通过SA途径增强对生物营养型病原的抗性。低Pi条件下P. polysora感染导致离子渗漏最高但真菌DNA含量最低，研究人员推测低Pi严重削弱了防御反应，P. polysora在感染早期即引起细胞死亡，而细胞死亡反过来又限制了这一生物营养型病原的增殖；相比之下，半生物营养型病原C. lunata因其坏死营养阶段而能在该条件下有效增殖。研究进一步指出，P对病害抗性的影响在不同植物物种间存在差异，在拟南芥中P积累促进对坏死营养型和半生物营养型真菌的抗性，而在水稻中高Pi降低对Magnaporthe oryzae的抗性，表明P的作用取决于宿主-病原体的精细平衡。

关于P通过增强PTI相关反应正向调控玉米抗病性的机制，研究表明P通过增强PTI相关反应而非直接影响真菌生长来增强玉米对SCR和CLS的抗性。高Pi条件下PTI标记基因表达增加、ROS爆发增强、MAPK磷酸化增强，尤其在flg22处理后。低Pi条件下B73和携带RppK的K22对SCR的抗性均受损，表明P对玉米先天免疫至关重要。未来研究需探讨其他PAMPs如几丁质诱导的PTI是否也被P增强、P增强PTI是否直接促进病原菌抑制、P增强玉米PTI反应的确切分子机制，以及苯丙烷途径基因和SA生物合成基因上调与JA生物合成基因未上调之间的防御激素和代谢物交互作用。

研究人员还强调P对植物生长与防御的协调调控作用。les33中P过量积累在增强SCR和CLS抗性的同时因免疫反应过度激活而损害植物生长，这种权衡凸显了优化P管理策略的必要性。高Pi处理触发包括MAPK磷酸化增强、防御相关基因上调、SA、S-木质素、类黄酮积累增加在内的强免疫反应，但代价是抑制植物生长。因此建议在田间实施优化的Pi施用以平衡免疫与生长，最大化经济回报。研究最后展望认为，P介导的营养免疫是玉米病害管理的有前景策略，田间Pi肥施用有效增强SCR抗性，特别是在低P地区。然而需谨慎确定Pi肥增加施用是否以及如何影响玉米产量和品质相关性状，过量Pi施用因增加生产成本、导致水体污染和富营养化、浪费有限磷资源并造成植物养分失衡而不可取。基于上述结果，优化Pi施肥是协调生长与免疫的可行策略，该策略也可能适用于其他作物。此外，鉴于ZmPHO2的负调控作用，筛选ZmPHO2表达适度降低的玉米等位基因对于优化玉米磷吸收、培育磷高效和抗病玉米品种具有重要意义。

综上所述，该研究通过突变体筛选和图位克隆证明，ZmPHO2功能缺失突变同时增强Pi吸收和对SCR及CLS的抗性。后续实验揭示P通过增强PTI相关反应增强玉米病害抗性，Pi肥料可支持田间对SCR的抑制。