《Biotechnology Progress》：SIM-CaliRam: A workflow combining simulation-informed references and biomass-augmented features for in-line Raman calibration of Saccharomyces cerevisiae
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拉曼光谱是上游生物过程一种有前景的原位过程分析技术（PAT），但由于稀疏的样本参考（SaR）以及生物量诱导的荧光和浊度效应引起的预测漂移，将已训练的校准模型迁移至新的独立发酵批次而无需重新校准仍是一项挑战。研究人员提出了SIM-CaliRam，一种结合两项物理
拉曼光谱是上游生物过程一种有前景的原位过程分析技术（PAT），但由于稀疏的样本参考（SaR）以及生物量诱导的荧光和浊度效应引起的预测漂移，将已训练的校准模型迁移至新的独立发酵批次而无需重新校准仍是一项挑战。研究人员提出了SIM-CaliRam，一种结合两项物理动机干预的校准工作流。首先，模拟信息参考（SiR）通过在一次专用未接种的非反应性补料批次运行上应用补料驱动的非反应性质量平衡，将葡萄糖、铵和磷酸盐标签致密化，其中底物动态由补料和稀释决定。SiR标签与SaR值高度一致。此外，生物量增强特征（BaF）将拉曼预测的生物量作为额外的底物模型回归变量附加，为特征空间中残余的生物量诱导光谱混杂提供代理。该工作流在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）发酵上进行了演示，并在已建立预处理选项和六种校准方法（涵盖线性、贝叶斯非参数和神经网络方法）上进行了系统性网格搜索评估。传统SaR校准作为基线。训练使用两个AV批次运行，模型选择在单独的CV运行上进行，最终评估在留出的TEST运行上进行。最佳选择模型在TEST上的归一化均方根误差（NRMSETEST）分别为0.203（生物量，SaR）、0.206（葡萄糖，SiR）、0.350（铵，SiR + BaF）和0.598（磷酸盐，SiR）。相对于SaR（R2 = ?1.2），SiR改善了磷酸盐预测（R2 = 0.64），尽管剩余预测误差限制了独立过程控制应用。所选预处理、学习器和增强配置因分析物而异。这些结果支持针对特定目标的模型选择而非通用校准流水线。
研究背景方面，光谱软传感器是过程分析技术（PAT）的成熟组成部分，能够实时推断难以在线测量或需要昂贵离线测定的过程状态，支持上游生物过程中的监测、控制和优化。在UV/Vis、荧光、近红外（NIR）、中红外（MIR）和拉曼等光谱PAT方法中，化学选择性、对水基质的敏感性和实际部署复杂性存在明显权衡。拉曼光谱对水性发酵培养基尤其具有吸引力，因为其非弹性散射机制产生独特的分子指纹，且受水吸收干扰较小。然而，在搅拌微生物生物反应器中进行稳健的在线校准仍然是一个实际挑战。具体而言，在酿酒酵母（S. cerevisiae）补料分批培养等密集微生物肉汤中，原位探头持续暴露于完全未稀释的细胞悬液，生长细胞产生生物量诱导的光谱混杂，如宽带荧光发射可能主导弱拉曼信号，而细胞密度增加则提高浊度和散射，以标准预处理无法完全校正的方式改变有效光程。此外，酿酒酵母细胞壁富含由葡萄糖残基组装的β-葡聚糖，因此增加的生物量对溶解葡萄糖信号产生光谱相关的混杂贡献。模型迁移的瓶颈主要是参考稀缺性，因为离线湿实验室测定昂贵、相对于连续在线光谱采集异步到达，且通常每次运行和每种分析物仅提供有限数量的参考时间点。这种高频光谱与低频、目标特异性离线测定的多速率设置是生物过程监测中常见的软传感器挑战，因为当过程条件或光学背景变化时，它可能放大批次间漂移。已报道的具有跨设置可迁移性的通用拉曼校准模型需要大型、高度多样化的多站点数据集，这突显了校准迁移的重要性和纯数据驱动稳健性的巨大数据需求。这促使研究人员探索互补策略，以减少湿实验室标签需求并解决浑浊微生物肉汤中生物量诱导的光谱混杂。在酿酒酵母拉曼研究中，可区分三种广泛的校准路线：基于稀疏离线样本参考（SaR）的过程特异性化学计量学模型、针对生物量诱导光谱混杂的光学或基质校正策略、以及以减少对大型过程特异性数据集依赖为导向的简化校准和迁移策略。只有部分研究包含外部独立测试，严格的按批次AV、CV和TEST评估协议仍然罕见。
研究人员开展了SIM-CaliRam工作流研究，该工作流结合两项针对性干预：模拟信息参考（SiR）和生物量增强特征（BaF）。SiR通过在一次专用未接种的非反应性补料批次运行中应用补料驱动的非反应性质量平衡，在光谱仪分辨率下为葡萄糖、铵和磷酸盐生成致密参考标签，该过程仅依赖于补料曲线、入口浓度和反应器体积，不依赖于菌株特异性动力学。BaF首先训练生物量的拉曼软传感器（第一阶段），然后将其预测用作底物模型的额外回归变量（第二阶段），受化学计量学中的多块回归和机器学习中的堆叠泛化原理启发。模型选择遵循严格的按批次协议，预处理和学习器配置仅在留出的CV发酵上选择，最终评估在独立的TEST发酵上进行。两项干预均使用光谱校准文献中常用的代表性学习器家族进行评估，包括偏最小二乘法（PLS1/PLS2）、高斯过程回归（GPR）和三种神经网络架构（CNN-GEN、CID-CNN、MLP），以及已建立的预处理选项如airPLS基线校正、标准正态变量归一化（SNV）、Savitzky–Golay导数（SG）和基于指纹的波数选择（WS）。研究结果表明，在独立的留出TEST发酵上，在训练批次（AV-01、AV-02）上校准并在CV批次上选择的模型达到了：生物量（R2 = 0.959，RMSEP = 1.54 g/L；SaR-GPR）、葡萄糖（R2 = 0.957，RMSEP = 1.70 g/L；SiR-GPR）、铵（R2 = 0.877，RMSEP = 0.12 g/L；SiR-PLS1 + BaF）和磷酸盐（R2 = 0.643，RMSEP = 0.23 g/L；SiR-GPR）。所有结果均未在TEST发酵上进行任何标记或重新校准。据研究人员所知，这是首次报道在密集酿酒酵母补料分批肉汤中进行铵和磷酸盐的定量原位拉曼预测并采用外部按批次TEST评估的研究。磷酸盐比较说明了SiR基于模型的性能相对于SaR基线在留出TEST发酵上的潜在优势。然而，剩余的磷酸盐预测误差和仅在单个独立TEST运行上的评估排除了对其普遍实际应用的主张。在六种学习器家族中，GPR被CV选择用于生物量、葡萄糖和磷酸盐，所选模型在留出TEST运行上保持了可比性能。此外，PLS1对铵特别具有竞争力，代表了在没有先进计算基础设施或时间限制的实验室中快速校准的实用选择，因为PLS校准在几秒内完成。神经网络（CNN-GEN、CID-CNN、MLP）在当前小数据体制下表现出不太一致且通常更高的CV误差。其中，MLP是最具竞争力的神经网络架构，受益于限制输入维度的波数带预选择。结果不支持跨所有四个目标的通用学习器、预处理流水线或增强策略。相反，CV选择的配置强烈依赖于分析物。这是所提出工作流的核心成果。光谱预处理、学习器选择、SiR监督和可选的BaF增强应被视为候选校准决策，并使用独立的按批次验证进行目标特异性评估。因此，SiR和BaF并非作为每种分析物的强制组件提出。它们提供额外的、物理动机的校准选项，当它们改善独立CV性能时可保留，否则可拒绝。SiR的一个进一步实际意义是其在早期菌株或工艺开发中的潜在用途，其中完全接种的校准发酵可能昂贵或尚不可用。在这种情况下，在相同物理操作条件下进行的未接种非反应性补料批次运行可为廉价且剂量良好的培养基组分提供致密的补料驱动底物参考轨迹（SiR数据）。对于处理相关拉曼校准挑战的实践者，本研究结果提出三项实用建议：实验运行应在批次水平上分为不同的训练、模型选择和留出测试角色（AV/CV/TEST），而非依赖随机样本分割，以获得现实的部署估计；预处理和学习器选择应被视为目标和设置特异性的模型选择变量而非固定设置；当文献引导的目标波段可用时，应将其作为候选波数选择设置纳入网格搜索。本研究的主要局限性是单生物、单发酵罐范围。所有结果均在一种生物反应器配置中的酿酒酵母培养上获得。此外，所有TEST指标均来自单个留出TEST发酵。因此，它们表征了校准向一个未见批次的迁移，并未量化跨生物重复的批次间变异性，这需要额外的独立发酵。未来工作将通过将该工作流应用于黑曲霉（Aspergillus niger）发酵来评估跨生物可迁移性，其中形态依赖性浊度呈现更严峻的校准挑战，并通过将递归模型更新与机制状态估计相结合来扩展SiR超越非反应性近似。
在技术方法方面，研究人员使用了以下主要关键技术方法：采用四组独立实验运行，包括一次未接种非反应性补料批次运行（AV-01）用于SiR标签生成、一次高细胞密度接种补料分批运行（AV-02）用于模型训练、一次标准密度接种补料分批运行（CV）用于模型选择、一次标准密度接种补料分批运行（TEST）用于最终评估；使用785 nm过程光谱仪进行在线拉曼光谱采集；通过补料驱动非反应性质量平衡的常微分方程（ODE）积分生成SiR标签；采用两阶段顺序校准策略实现BaF；在24种预处理配置（airPLS × SNV × SG × WS）与BaF开关及两种标签条件的组合上进行系统性网格搜索；使用六种学习器家族（PLS1、PLS2、GPR、CNN-GEN、CID-CNN、MLP）进行回归建模；采用按批次的AV/CV/TEST评估协议，以NRMSECV为唯一模型选择标准。
研究结果方面，光谱特征分析表明原始拉曼光谱呈现显著的背景贡献，不同实验和培养阶段强度水平不同，经airPLS校正后所有四次运行中仍可见明显光谱特征，未接种的AV-01实验显示出显著的时间依赖性变化，特别是在1050–1140 cm?1附近，所有运行中约1300–1400 cm?1处可见宽带，这些观察结果说明了校准和评估过程中遇到的异质光谱条件。SiR参考标签一致性分析表明，在11个AV-01采样时间点上SiR与SaR的直接比较显示所有三种底物高度一致，葡萄糖的RMSE/NRMSE/R2为0.445 g/L/0.052/0.997，铵为0.057 g/L/0.049/0.998，磷酸盐为0.027 g/L/0.053/0.997，相应的RMSE值在所有三种底物上均等于或低于分析标准差，此外在匹配标签密度下用SiR值替代SaR值对PLS1预测性能的影响可忽略不计。拉曼校准结果表明，对于生物量预测，SaR条件下GPR产生更好的NRMSECV（0.226 vs. 0.240），所选的SaR-GPR生物量预测器随后用作所有底物目标的固定BaF回归变量，最佳CV选择的生物量模型在留出TEST运行上达到NRMSETEST = 0.203（RMSEP = 1.54 g/L，R2 = 0.959）。对于葡萄糖预测，最佳CV选择的葡萄糖模型（SiR-GPR，无BaF）达到NRMSECV = 0.197和NRMSETEST = 0.206（RMSEP = 1.70 g/L，R2 = 0.957），BaF增强被选择用于PLS1但未用于GPR。对于铵预测，最佳CV选择的铵模型（SiR-PLS1 + BaF）达到NRMSECV = 0.310和NRMSETEST = 0.350（R2 = 0.877，RMSEP = 0.12 g/L），BaF在SiR条件下被所有六种学习器家族选择，在SaR条件下被六种学习器家族中的四种选择，神经网络在该目标上竞争力显著较低。对于磷酸盐预测，磷酸盐是本研究中最具挑战性的分析物，最佳CV选择的磷酸盐模型（SiR-GPR，无BaF）在留出TEST发酵上达到NRMSETEST = 0.598（R2 = 0.643，RMSEP = 0.23 g/L）。连续监测方面，在校准模型能够在隔夜期间离线采样通常无法实现时跟踪补料添加引起的葡萄糖浓度变化，拉曼软传感器在光谱仪分辨率下提供不间断估计，弥合了发酵操作固有的离散参考测定之间的差距。
讨论部分总结了SiR的效果、BaF的效果以及模型比较和实际意义。关于SiR的效果，SiR提供致密的、物理一致的参考轨迹而无需额外湿实验室工作，它仅依赖于补料曲线和反应器体积而非菌株特异性动力学。在葡萄糖和铵上，SiR在CV选择下产生小到中等程度的改善，而磷酸盐说明了一个关键的部署效应：尽管CV误差具有竞争力，但仅SaR校准在独立TEST运行上失败，而SiR恢复了稳定的预测器。由于CV选择的SaR和SiR磷酸盐模型在学习器上也有所不同（PLS1 vs. GPR），该比较反映了完整的所选流水线。它表明仅CV性能可能是向未见批次迁移的差指标，但不能分离标签密度的效应。在用于在线再训练的线性生物量模型中，SiR条件下具有目标特异性波数选择的PLS1达到NRMSECV = 0.332，而SaR条件下为0.547。关于BaF的效果，将拉曼预测的生物量作为额外回归变量附加为底物模型提供了对生物量诱导效应（如荧光、浊度和散射伪影）所致的残余光谱混杂的显式代理，这些效应是预处理 alone 无法完全去除的。在本研究中，益处对铵最为显著。BaF在SiR条件下被所有六种学习器家族选择，在SaR条件下被四种学习器家族选择，这与N-H变形带和1400–1500 cm?1区域生物量贡献之间的结构重叠一致。对于葡萄糖，BaF在最佳PLS1配置中被选择但未在GPR中；对于磷酸盐，BaF未在最佳GPR配置中被选择。关于模型比较和实际意义，GPR和PLS的性能因目标而异。GPR被选择用于生物量、葡萄糖和磷酸盐，而PLS1对铵达到最低NRMSECV。在SiR条件下，GPR在生物量、葡萄糖和磷酸盐上达到比PLS1更低的NRMSECV，而PLS1在铵上表现更好。神经网络模型显示出显著更高的预测误差，在本小数据体制下表现不如GPR和PLS。MLP是最具竞争力的神经架构。对于磷酸盐，SiR提供的留出TEST性能显著优于SaR，但剩余的绝对预测误差仍然相当大。磷酸盐模型尚不应被视为足以进行独立过程控制部署。本比较的核心结果不是识别普遍最优的学习器或预处理流水线，而是所选配置在目标之间差异显著。这种目标依赖性支持将预处理、学习器选择、SiR和BaF视为候选模型选择变量而非通用校准配方的固定组件。
结论部分翻译如下：研究人员提出了SIM-CaliRam，一种用于上游生物过程中原位拉曼光谱的实用校准工作流，结合两项互补的、物理动机的干预：SiR通过从补料驱动质量平衡导出参考轨迹来致密化监督而无需额外湿实验室工作，BaF通过将拉曼预测的生物量信号作为底物模型的辅助回归变量附加来捕获残余的生物量诱导光谱混杂。在独立的留出TEST发酵上，在训练批次（AV-01、AV-02）上校准并在CV批次上选择的模型达到了：生物量（R2 = 0.959，RMSEP = 1.54 g/L；SaR-GPR）、葡萄糖（R2 = 0.957，RMSEP = 1.70 g/L；SiR-GPR）、铵（R2 = 0.877，RMSEP = 0.12 g/L；SiR-PLS1 + BaF）和磷酸盐（R2 = 0.643，RMSEP = 0.23 g/L；SiR-GPR）。所有结果均未在TEST发酵上进行任何标记或重新校准。据研究人员所知，这是首次报道在密集酿酒酵母补料分批肉汤中进行铵和磷酸盐的定量原位拉曼预测并采用外部按批次TEST评估的研究。磷酸盐比较说明了SiR基于模型的性能相对于SaR基线在留出TEST发酵上的潜在优势。然而，剩余的磷酸盐预测误差和仅在单个独立TEST运行上的评估排除了对其普遍实际应用的主张。在六种学习器家族中，GPR被CV选择用于生物量、葡萄糖和磷酸盐，所选模型在留出TEST运行上保持了可比性能。此外，PLS1对铵特别具有竞争力，代表了在没有先进计算基础设施或时间限制的实验室中快速校准的实用选择。神经网络在当前小数据体制下表现出不太一致且通常更高的CV误差。结果不支持跨所有四个目标的通用学习器、预处理流水线或增强策略。相反，CV选择的配置强烈依赖于分析物。这是所提出工作流的核心成果。光谱预处理、学习器选择、SiR监督和可选的BaF增强应被视为候选校准决策，并使用独立的按批次验证进行目标特异性评估。因此，SiR和BaF并非作为每种分析物的强制组件提出。它们提供额外的、物理动机的校准选项，当它们改善独立CV性能时可保留，否则可拒绝。SiR的一个进一步实际意义是其在早期菌株或工艺开发中的潜在用途。对于处理相关拉曼校准挑战的实践者，本研究结果提出三项实用建议：实验运行应在批次水平上分为不同的训练、模型选择和留出测试角色；预处理和学习器选择应被视为目标和设置特异性的模型选择变量；当文献引导的目标波段可用时，应将其作为候选波数选择设置纳入网格搜索。本研究的主要局限性是单生物、单发酵罐范围，所有TEST指标均来自单个留出TEST发酵，因此表征了校准向一个未见批次的迁移，并未量化跨生物重复的批次间变异性。未来工作将评估跨生物可迁移性并整合递归模型更新与机制状态估计。
