基于SESI-HRMS的长时间禁食期间呼出气特征的日内时间动态变化：一项试点研究

《Talanta》：Within-day temporal dynamics of exhaled breath features during prolonged fasting monitored by SESI-HRMS: a pilot study

　　

SESI-HRMS揭示了长时间禁食期间呼出气特征的动态时间变化。密集呼气采样捕获了高分辨率的纵向挥发性有机化合物（VOCs）谱图。丙酮和戊醛在禁食期间逐渐增加。经过环境背景过滤后，保留了29个稳健的质荷比（m/z）特征。咬嘴更换引入了可测量的前分析信号变异。

呼出气分析作为一种非侵入性检测手段在疾病诊断和健康监测方面具有潜力，但该领域方法学标准化尚不充分，环境污染物和生理状态变化等因素会干扰内源性信号。禁食常被用作采样前的标准化策略以减少食物来源的干扰，但禁食本身会引起脂质动员和酮体生成等代谢适应，从而可能改变呼气轮廓。已有研究表明丙酮在禁食期间显著升高，食物摄入使其降低，但以高时间分辨率系统评估长时间禁食期间呼气特征动态变化的研究仍然缺乏。本研究作为一项数据质量和前分析层面的试点研究，旨在严格标准化的采样条件下，利用二次电喷雾电离耦合高分辨Orbitrap质谱（SESI-HRMS）和密集纵向采样，表征长时间禁食测量日内呼气代谢物特征的时间变化。

研究人员招募了3名健康志愿者（S1，男，32岁；S2，女，27岁；S3，男，65岁），其中S1和S2同一天测量，S3单独一天测量。志愿者在前一晚19:00至19:30进食由水煮鸡胸肉和印度香米组成的标准化低芳香晚餐，此后禁食至次日18:00采样结束。采样从08:00开始，每15分钟一个测量周期直至18:00，共41个周期，在正负离子模式下采集呼出气和实验室空气背景。SESI-HRMS设置名义分辨率为140,000，全扫描范围m/z 50-500。每个呼气周期包含至少三次稳定呼气，呼气平台的前后各20%被排除，仅保留稳定中心区。目标分析基于16种常见呼吸挥发性有机化合物（VOCs）的理论m/z进行匹配；非目标分析通过特征聚类、线性回归和Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）校正评估时间趋势，并施加以背景为准的筛选条件。研究还比较了原始强度、概率商归一化（PQN）、中位数归一化和排除丙酮的总离子流（TIC）归一化四种处理方法。

研究结果如下：
3.1 质谱图比较。最早（08:00）与最晚（18:00）时间点的平均质谱显示明显的谱图差异，尤其对S1和S2。m/z 59.0494处特征（与质子化丙酮推定一致）在18:00显著增强并占据总离子信号较大比例，与禁食期间酮体生成增加相符，S3的升高则较不显著。
3.2 目标化合物的时间依赖趋势。在初选的16种目标VOC中，3个特征（丙酮、异戊二烯和戊醛，均为推定注释）通过信号筛选并显示显著时间变化。进一步施加背景准则后，仅丙酮相关特征和戊醛相关特征符合预设要求。丙酮相关特征在所有受试者中均高于环境背景并随时间增加，其中S1和S2的趋势显著，S3（年龄最大且在不同日期测量）不显著（FDR校正p = 0.77）。戊醛相关特征也呈上升轨迹，但其结构归属可靠性较低，应视为推定。
3.3 非靶向时间特征筛选。在非靶向筛选中，高频检测和样本出现率过滤（≥80%扫描和≥80%样本）移除了大多数不稳定的候选峰。背景过滤前，正离子模式122个特征和负离子模式29个特征满足显著性一致趋势标准；背景准则应用后保留60个特征（正离子模式41个、负离子模式19个）。
3.4 非靶向特征敏感性分析。四种归一化方法在正离子模式下保留特征数相近，而负离子模式下特征保留数波动更大（17-27个），说明负离子模式结果更依赖处理方法。正离子模式有108个特征在全部四种方法下均通过显著性筛选且趋势方向一致，其中40个也通过背景筛选；负离子模式仅12个特征具有跨方法一致性。最终51个特征通过全部筛选。在变化幅度最大的前10个特征中，排名第二的m/z 59.0494为推定质子化丙酮；排名第一的m/z 61.0535以及m/z 60.0556、61.0560的相对强度与m/z 59.0494的¹⁸O、²H和¹³C₂同位素峰一致，因此很可能追踪同一化合物。全部前10特征均呈上升趋势，51个通过特征中有11个呈下降趋势。

讨论部分指出，SESI-HRMS通常以质子转移为优势电离途径，但钠、钾和铵加合物的存在可能使仅基于质子化离子的匹配策略不完整，因此特征级注释应视为初步。采样界面方面，S3初次测量期间两次更换咬嘴的时间点恰好出现多个特征信号的阶跃式变化，z分数均为正值且相应实验室空白测量中也出现尖峰，提示外源物质释放或传输条件改变，但由于未设计随机化和重复实验，该观察只能视为探索性假设。实验室空气分析显示部分特征的环境信号等于甚至超过呼气信号，强调了时间匹配背景的必要性。口腔冲洗、低芳香标准餐和限制体力活动等标准化措施也被讨论为潜在干扰来源。由于呼气平台首尾段信号不稳定，研究人员将其排除仅使用中心稳定区；CO₂传感器未校准，因此未采用CO₂归一化。

本研究的局限性包括样本量仅3人、年龄和性别差异大、S3单独日期测量；禁食持续时间与时间和仪器运行时间完全混杂，无法区分禁食生理、昼夜节律和仪器漂移；化合物鉴定未使用标准品确认；缺乏连续内标和校准的CO₂归一化。结论指出，呼出气特征谱在长时间禁食测量期间并非时间恒定，但由于上述混杂因素，不能将全部变化单独归因于禁食。研究建议未来的呼气分析研究报告禁食时长和采样时间，包含时间匹配的背景测量，控制并记录采样界面操作，并应用适当的分析质量控制。本研究为方法学试点而非群体水平禁食代谢表征，需要包含进食对照日、重复测量、随机化采样计划、内标和更强鉴定流程的更大规模对照研究来确定哪些时变特征可特异归因于禁食。