基于TaqMutS错配DNA识别机制的计算机模拟与实验分析：面向DNA信息存储的高保真纠错工具理性设计

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Computational and experimental analysis for the mismatched DNA recognition mechanism of TaqMutS

　　

DNA因其高密度、稳定性和低能耗而成为下一代信息存储材料的巨大潜力候选者。然而，高合成错误严重限制了其实际应用。基于Thermus aquaticus MutS（TaqMutS）的酶促纠错高效且简便，但其对完全匹配DNA的严重非特异性结合大幅降低了纠错性能。本研究通过丙氨酸扫描突变、同源替换突变和分子动力学模拟，系统分析了TaqMutS对错配DNA的识别机制。结果表明，TaqMutS通过感知DNA局部构象张力来识别错配位点。具体而言，由残基S57和D472介导的协同推-拉机制调控了关键识别残基F39与DNA之间的π-堆积相互作用。同时，残基K61和R473的静电协同效应有效调控了TaqMutS的非特异性DNA结合。基于这些发现，研究人员构建了两个突变体（V57S和K61H），其对错配DNA的结合效率增强，对完全匹配DNA的亲和力降低。总体而言，本研究为高效DNA合成提供了有用的纠错工具，并为错配DNA识别蛋白的理性设计奠定了重要理论基础。

DNA作为一种超越传统存储技术物理极限的下一代信息存储介质，因其超高存储密度、良好的化学稳定性和低存储能耗而备受关注。然而，DNA信息存储数据写入过程中的关键问题——包括DNA合成的高成本、低速度和高错误率——仍然制约着DNA作为数据存储介质的实际应用。其中，DNA合成过程中的副反应（如不完全偶联和错误掺入）导致错误率高达每千碱基1-3个错误，造成合成效率降低和生产成本增加。此外，由于错误随DNA片段长度呈指数累积，长寡核苷酸池中正确序列的比例通常较低，仅5%-60%的序列完全正确。因此，采用纠错技术降低合成错误率可有效提高合成质量并降低生产成本。目前，基于分子量的筛选方法如高效液相色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳已被用于消除长度不匹配的错误序列，但这些方法劳动强度大且对单碱基缺失、插入或替换等微小错误无效。此外，杂交选择技术可过滤大量寡核苷酸，但所需寡核苷酸数量翻倍，导致纠错成本高昂。相比之下，错配DNA结合蛋白MutS能够从合成DNA文库中纠错并分离多种错误类型，在高保真DNA合成中展现出巨大潜力。

MutS是生物体DNA错配修复（MMR）系统的重要组成部分，能够识别并结合多种类型的错配DNA底物。目前用于纠错的MutS蛋白主要有两种类型，包括来自Thermus aquaticus的TaqMutS和来自Escherichia coli的EcoMutS。其中，EcoMutS相比TaqMutS表现出更优越的特异性错配DNA识别能力，尤其是对G-T错配具有最高亲和力。然而，EcoMutS热稳定性较差，其纠错能力在7天后逐渐下降，21天后纠错效率降至原始活性的90%以下。相比之下，TaqMutS具有更高的稳定性，可在广泛的pH和温度范围（0-70 °C）内保持原始活性，使其广泛适用于DNA合成中的纠错以及遗传疾病的检测。然而，TaqMutS在DNA纠错流程中表现出突出的非特异性结合，导致完全匹配的DNA被错误识别为错配序列而被不期望地去除，显著降低了纠错效率。因此，降低非特异性识别并增强TaqMutS的特异性结合可以提高纠错的准确性。

为提高TaqMutS的纠错性能，全面了解其结构特征对于建立错配DNA识别的分子基础至关重要。TaqMutS由同源二聚体组成，每个单体包含五个结构域（I-V），DNA分子结合在两个亚基之间的闭合腔中，主要与结构域I和IV相互作用。其中，结构域I中的F39和E41已被鉴定在体外错配识别中发挥关键作用，因为它们能与含有错配碱基的异源双链DNA形成特异性交联。与其他MutS家族蛋白类似，TaqMutS在识别并结合错配DNA后发生构象变化，形成滑动夹结构并与其他错配修复蛋白相互作用以促进DNA修复。然而，TaqMutS识别错配DNA的详细机制尚未完全阐明，尤其是其高非特异性结合的结构基础。

本研究全面研究了TaqMutS识别错配DNA的分子基础。利用序列比对和分子动力学（MD）模拟筛选TaqMutS的关键识别结构域，并进行电泳迁移率变动分析以分析其非特异性结合谱。基于这些发现，开展丙氨酸扫描突变以鉴定介导非特异性相互作用的关键残基，同时采用同源替换以阐明其错配DNA检测的分子基础。

研究人员开展了以下研究：首先，表达了EcoMutS和TaqMutS并通过Ni-NTA琼脂糖亲和色谱纯化，通过SDS-PAGE验证纯度（EcoMutS约98 kDa，TaqMutS约95 kDa）。选取六种代表性复制损伤类型（A/G、C/T、G/A、G/T、T/C错配和单碱基缺失），通过电泳迁移率变动分析（EMSA）定量分析错配结合能力。结果显示TaqMutS对A/G、C/T、G/A、G/T、T/C错配和单碱基缺失的结合效率分别为78.6%、36.8%、59.1%、59.9%、69.7%和71.7%，比EcoMutS相应值低4.5%-26.2%。值得注意的是，TaqMutS对完全匹配DNA的非特异性结合水平达到39.6%，远高于EcoMutS的7.2%。尽管TaqMutS的错配DNA识别效率较低且非特异性结合较强，但其具有显著的热稳定性，在生物技术应用中具有不可替代的优势。因此，选择TaqMutS作为模型蛋白分析其错配DNA识别机制。

由于TaqMutS对A/G错配表现出最高结合亲和力，选择该错配类型进行后续计算模拟。为鉴定参与错配DNA识别的关键残基，分析了TaqMutS结合完全匹配DNA和A/G错配DNA之间的动态构象特性和分子间相互作用能差异。选取由核心错配碱基对（DG9:DT22）及其相邻上下游碱基对（DC8:DG23和DC10:DG21）组成的三联体区域，研究了该区域5 ?半径内的23个残基。随后，对TaqMutS-匹配DNA和TaqMutS-错配DNA复合物体系应用MM/GBSA残基分解方法。|ΔΔG| < 1 kcal/mol的残基被排除在进一步分析之外。结合MutS家族进化保守性分析结果，高度保守的功能位点（F39、Y40和E41）被进一步排除。据此，筛选出6个潜在影响TaqMutS错配DNA结合的残基，即V36、V57、K61、R76、D472和R473。

随后进行丙氨酸扫描突变以表征这些位点对TaqMutS错配DNA识别能力的影响。通过SDS-PAGE和蛋白质浓度测定评估这些突变体的纯化性能。大多数突变体可成功纯化，浓度为0.38-0.70 mg/mL，而D472A显示出明显较弱的蛋白条带和显著较低的蛋白浓度（0.07 mg/mL）。结构分析表明，D472在TaqMutS中与R473形成局部氢键相互作用，而D472A突变破坏了这一相互作用网络。进一步的残基水平溶解度和聚集倾向分析定量监测了这些结构变化。与野生型（WT）相比，突变体D472A在472位点周围残基的预测溶解度较低。为量化突变驱动的聚集倾向增加，采用两个成熟的序列衍生计算指标TA和Na4vSS进行比较分析。TA反映局部蛋白质区域的整体疏水聚集倾向面积，Na4vSS量化残基特异性内在聚集倾向。该突变使两个聚集相关参数均升高：TA值从-23增至-21，Na4vSS值从-4.9升至-4.6。总之，这些计算分析证实D472A突变降低了该局部环的溶解度并增加了其内在聚集倾向。所有突变体与完全匹配DNA的结合率均显著降至<20%，表明这些残基与TaqMutS的非特异性结合相关。此外，所有突变体的错配DNA结合能力均明显受损，尤其是V36A和V57A。具体而言，V36A突变体完全丧失了对A/G和C/T错配的结合能力（结合率<10%），对其他错配（G/T、T/C和单碱基缺失）的结合效率也降至40%-65%。V57A突变体仅保留了对T/C错配（65.0%）和单碱基缺失（64.2%）的结合活性，而对A/G、C/T和G/T错配的结合几乎完全丧失。尽管K61A和R76A突变体降低了蛋白质对正确碱基配对DNA的结合亲和力，但也削弱了对错配DNA底物的结合能力。总体而言，这些结果表明V36、V57、K61、R76和R473是调控TaqMutS错配DNA识别的关键残基。其中，V36和V57对TaqMutS的错配DNA结合能力影响尤为突出。然而，D472A突变体在本研究中未能获得，其错配DNA识别的确切功能贡献尚未表征。

EcoMutS在错配DNA识别方面表现出优于TaqMutS的性能，具有对多种错配DNA底物增强的结合亲和力和对完全匹配DNA降低的非特异性结合。据此，基于EcoMutS和TaqMutS之间的序列比对，在鉴定的关键残基处设计了同源替换突变（V36M、V57S、K61R、R76H、D472N和R473A）。通过SDS-PAGE和蛋白质浓度定量确认了这些突变体的成功纯化。评估了它们对各种DNA底物的结合效率。其中，V36M对完全匹配DNA的结合率降至17.5%，但对C/T、G/T错配和单碱基缺失DNA的结合效率急剧下降至10%以下。V57S的非特异性结合效率显著降至28.2%，同时对A/G错配和单碱基缺失DNA的识别效率大幅提高至98.4%和94.9%。尽管K61R对所有错配类型显示出高结合效率（80.0%-95.2%），但其非特异性结合效率增至71.8%。值得注意的是，D472N对所有DNA底物表现出无差别结合，效率高达98%，表明其完全丧失了区分匹配和错配DNA的能力。基于这些发现，随后进行高斯加速分子动力学（GaMD）模拟以分析这些关键残基处的突变如何调节TaqMutS的构象动力学，从而 decipher 其错配DNA识别行为的分子基础。

据报道，DNA错配可诱导以错配碱基对为中心的双螺旋局部扭曲，TaqMutS的错配DNA识别机制被认为依赖于这种结构扭曲。据此，以A/G错配碱基对为核心，选取其相邻上下游碱基对，分析这些碱基对之间的氢键数量和堆积角度，以探究结合WT TaqMutS及其突变体的错配DNA的局部构象扭曲。在WT-匹配DNA复合物中，三个碱基对之间形成7-9个氢键。同时，DC8、DA9和DC10的碱基堆积角范围为150°-180°，显示平行堆积趋势，表明这些碱基对维持经典双螺旋结构。相反，在WT-A/G错配DNA复合物中，这三个碱基对之间的氢键数量降至4-7个。对于V57S突变体，氢键数量进一步降至3-6个，表明错配位点出现显著局部扭曲和错配碱基间氢键相互作用减弱。此外，在WT-A/G错配DNA复合物中，错配碱基DG9与其侧翼碱基之间的π-堆积角主要分布在125°和150°。相比之下，V57S中相应的π-堆积角主要在120°，揭示了平行碱基堆积的破坏和错配DNA的明显局部扭曲。总之，这些结果表明错配DNA内的局部凸起扭曲是TaqMutS识别的关键决定因素，且扭曲程度与其结合效率密切相关。

在WT-错配DNA复合物中，V57@CG与DG9@P之间的距离为5-6 ?。相比之下，在V57S-错配DNA复合物中，S57@OG与DG9@P之间的距离分布在2-5 ?，这归因于S57侧链羟基与错配DNA骨架磷酸基团之间形成的氢键。由于V/S57在空间上与F39相邻，S57与错配DNA之间的氢键相互作用可将错配DNA推向F39。由于F39被认为是错配DNA识别的关键残基，研究人员进一步分析了F39与错配DNA之间的相互作用。在V57S-错配DNA复合物中，F39苯环与DC8碱基环之间的距离约为4 ?，而F39苯环与DG9碱基环之间的距离维持在约6 ?。相比之下，在WT-错配DNA复合物中，F39苯环与DC8和DG9碱基环之间的距离均维持在约7 ?。这些结果表明V57S中F39与DNA错配位点之间的π-堆积相互作用更强，这是由S57与错配DNA之间的氢键缩短距离从而稳定F39的结合所致。值得注意的是，在WT-匹配DNA复合物中，F39苯环与DA9碱基之间的距离超过10 ?，进一步表明TaqMutS对错配DNA的特异性识别与F39和错配位点之间的相互作用高度相关。

此外，D472N突变体丧失区分匹配和错配DNA的能力并表现出高水平非特异性结合（>98%），表明该位点对TaqMutS的特异性识别尤为关键。在WT-匹配DNA系统中，D472与匹配DNA之间的距离超过8 ?。然而，在D472N突变体中，N472与DNA之间的距离小于4 ?。此外，WT系统中D472与匹配DNA的接触频率低于20%，而D472N突变体中N472与匹配DNA的接触频率超过75%。这一现象归因于N472与匹配DNA磷酸骨架之间形成新的氢键，将DNA链拉近蛋白质并进一步破坏DNA双螺旋的平行堆积。重要的是，D472N系统中的DNA链倾向于远离F39，导致F39与DNA之间的接触频率显著降低。因此，这些结果表明D472在排斥DNA链和维持TaqMutS对DNA的特异性识别中发挥关键作用。D472的负电荷可能排斥DNA带负电的磷酸骨架，从而将DNA链推向F39（错配DNA识别的关键残基）并促进TaqMutS与错配DNA的特异性结合。为验证这种效应是否依赖于带负电的侧链，构建了D472E突变体。D472E恢复了识别错配DNA的能力，证实由带负电侧链介导的DNA排斥效应对TaqMutS的错配DNA识别至关重要。总之，这些结果表明残基472与错配DNA之间的距离与残基57与错配DNA之间的距离呈负相关。具体而言，在V57S突变体中，错配DNA更靠近S57和F39但更远离D472，表现出增强的错配DNA区分能力。在D472N突变体中，错配DNA远离V57和F39但更靠近N472，无法区分完全匹配和错配DNA。因此，研究人员提出S57和D472通过推-拉机制协同调控F39与错配DNA之间的距离，从而调节TaqMutS的错配DNA识别。

为探究V57S降低非特异性结合的分子机制，构建了WT和V57S分别结合正确DNA的复合物体系进行100 ns GaMD模拟。结果表明，在WT-匹配DNA复合物中，R473和R475与DNA形成稳定氢键。具体而言，R473@CZ与DT22@P之间的距离为4-5 ?，R475@CZ与DG23@P之间的距离维持在约4 ?，表明这些精氨酸残基与匹配DNA之间存在稳定氢键相互作用。相比之下，在V57S-匹配DNA复合物中，R473@CZ与DT22@P以及R475@CZ与DG23@P之间的距离分别为7-12 ?和5 ?。这些表明精氨酸与匹配DNA之间的氢键相互作用要么丧失要么显著减弱，导致V57S对匹配DNA的结合能力降低。此外，K61R突变体对匹配DNA的结合率从39.6%增至71.8%，表明K61位点参与调控TaqMutS的非特异性结合。接触频率分析显示，在WT复合物中K61与DNA碱基部分的接触频率较低，但与DNA磷酸骨架形成稳定氢键以稳定DNA结构。相比之下，在K61R复合物中R61与DNA碱基的接触频率较高但与磷酸骨架无相互作用。这一现象可能归因于精氨酸较长的侧链引起空间位阻，从而阻止了与DNA磷酸骨架形成氢键。由于K/R61和R473位于DNA两侧，它们对DNA磷酸骨架表现出竞争性结合。在WT复合物中，R473@CZ与DT22@P之间的距离超过5 ?，而在K61R复合物中该距离缩短至约4 ?。这些表明由于缺乏与R61的静电相互作用，匹配DNA转而与对侧的R473形成氢键，从而增强了TaqMutS的非特异性结合。为验证这一机制，将精氨酸突变为组氨酸以产生突变体K61H，其具有带正电荷且空间位阻较小的侧链。在K61H复合物中，R473@CZ与DT22@P之间的距离为5-8 ?，表明R473与匹配DNA之间的氢键被消除。相应地，K61H对匹配DNA的结合率降至20%以下。总之，这些结果证实K61通过调节与DNA的静电相互作用参与TaqMutS的非特异性结合。具体而言，R473可与DNA形成稳定氢键从而促进TaqMutS的非特异性结合；K61通过其带正电荷的侧链竞争性结合DNA磷酸骨架，使DNA远离R473并减少非特异性结合。

为评估引入的突变是否影响TaqMutS的错配DNA结合性能，表征了V57S和K61H在不同温度和长期储存条件下的错配DNA结合行为。在20-70 °C范围内，所有蛋白质维持相当的错配DNA结合效率。突变体V57S和K61H的结合效率超过80%，略高于WT。在4 °C储存24天后，两个变体几乎保持不变的错配DNA结合能力，表明其良好的储存稳定性。总之，这些结果表明两个单点突变未损害TaqMutS的固有错配DNA结合性能或储存稳定性。

为验证V57S和K61H的实际性能，对由完全匹配和含错配序列组成的定义DNA池进行TaqMutS介导的纠错实验。在纠错实验前，优化磁珠用量以高效捕获TaqMutS。未结合蛋白浓度随磁珠体积逐步增加而降低。40 μL磁珠体积足以实现完全蛋白质捕获，因此选用于后续纠错实验。纠错实验后，从上清液收集的DNA通过下一代DNA测序分析以定量完全匹配DNA和四种不同错配DNA底物的比例。在未处理的DNA池中，错配DNA序列占总测序读数的18.2%。四种错配底物的初始比例分别为3.5%（A/G）、3.9%（G/T）、3.8%（缺失）和7.0%（T/C）。经WT处理后，四种错配类型的比例降至2.5%（A/G）、2.5%（G/T）、1.1%（缺失）和2.4%（T/C）。值得注意的是，V57S变体可检测到所有错配类别的显著降低，比例分别为1.4%（A/G）、1.9%（G/T）、1.7%（缺失）和1.7%（T/C）。K61H观察到类似趋势，各错配类型的丰度降至1.6%（A/G）、1.7%（G/T）、1.3%（缺失）和1.7%（T/C）。与WT相比，V57S和K61H在识别和去除大多数类型错配DNA方面表现出更好的性能，但缺失底物除外。这些发现表明突变体V57S和K61H是DNA合成和DNA信息存储中有前景的纠错工具，其中合成衍生的序列错误经常损害序列保真度并限制DNA数据文库的可扩展性。这些变体可减轻错误累积并提高此类场景中合成DNA底物的整体可靠性。

结论部分：总之，本研究系统整合了丙氨酸扫描突变、同源替换突变和GaMD模拟以 decipher TaqMutS错配DNA识别的详细分子机制。研究人员鉴定出双链DNA的局部构象张力是TaqMutS特异性错配DNA区分的基本结构决定因素。具体而言，S57和D472通过推-拉机制协同控制关键识别残基F39的可及性：S57与DNA形成新氢键以稳定F39与错配碱基之间的π-堆积相互作用，而D472通过静电排斥调节DNA方向以促进错配DNA检测。同时，K61和R473通过静电效应协同抑制TaqMutS对完全匹配DNA的非特异性结合。据此，V57S和K61H表现出增强的识别特异性。它们对A/G错配DNA的结合效率分别达到98.4%和92.7%，而对完全匹配DNA的结合亲和力分别降至28.2%和16.9%。此外，突变体V57S和K61H在定制DNA池纠错实验中显示出改进的错配DNA去除能力。总体而言，本研究阐明了TaqMutS的内在错配DNA识别机制，为合理设计高特异性错配DNA识别蛋白以克服DNA信息存储中的DNA合成错误问题提供了理论指导。

讨论部分总结：本研究通过整合计算模拟与实验验证，系统解析了TaqMutS错配DNA识别的分子机制。研究揭示了TaqMutS通过感知DNA局部构象张力实现错配识别的结构基础，提出了S57/D472推-拉机制和K61/R473静电协同机制两个关键调控模式。基于机制分析设计的V57S和K61H突变体在保持热稳定性和储存稳定性的同时，显著提高了错配DNA结合特异性并降低了非特异性结合，在纠错实验中表现出优于WT的错配去除能力。该研究为DNA信息存储中合成错误校正提供了有效的工具蛋白，并为错配DNA识别蛋白的理性设计奠定了理论基础。研究结论翻译：总之，本研究系统整合了丙氨酸扫描突变、同源替换突变和GaMD模拟以阐明TaqMutS错配DNA识别的详细分子机制。研究人员鉴定出双链DNA的局部构象张力是TaqMutS特异性错配DNA区分的基本结构决定因素。具体而言，S57和D472通过推-拉机制协同控制关键识别残基F39的可及性：S57与DNA形成新氢键以稳定F39与错配碱基之间的π-堆积相互作用，而D472通过静电排斥调节DNA方向以促进错配DNA检测。同时，K61和R473通过静电效应协同抑制TaqMutS对完全匹配DNA的非特异性结合。据此，V57S和K61H表现出增强的识别特异性。它们对A/G错配DNA的结合效率分别达到98.4%和92.7%，而对完全匹配DNA的结合亲和力分别降至28.2%和16.9%。此外，突变体V57S和K61H在定制DNA池纠错实验中显示出改进的错配DNA去除能力。总体而言，本研究阐明了TaqMutS的内在错配DNA识别机制，为合理设计高特异性错配DNA识别蛋白以克服DNA信息存储中的DNA合成错误问题提供了理论指导。