脂滴靶向定位与代谢重构协同驱动红酵母Rhodotorula toruloides蓝光驱动烃类高效合成

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Integrated metabolic and process engineering of Rhodotorula toruloides for light-driven hydrocarbon production

　　

长链烃类是传统上通过石油炼制生产的大宗化学品。利用可再生资源进行微生物生产这类烃类已受到广泛关注，但受限于前体可及性与催化效率。本研究将基因工程与光生物过程优化相结合，实现产油酵母Rhodotorula toruloides的蓝光驱动烃类生产。在R. toruloides胞质中表达Chlorella variabilis脂肪酸光脱羧酶（CvFAP）可使细胞生产15.0 mg/L烃类，而通过与脂滴（LD）相关蛋白Ldp1融合将CvFAP靶向脂滴后，产量提高3倍以上。对蓝光发酵的系统优化使烃类产量进一步翻倍。对脂肪酸活化、脂质周转和类胡萝卜素生物合成相关途径的代谢重构表明，CRT1缺失效果最为显著，使烃类产量提高2.5倍。通过强化游离脂肪酸（FFA）供应和增加CvFAP拷贝数，产量得到进一步提升。最终菌株R. toruloides NF72D在摇瓶培养中生产557.7 mg/L烃类，比初始胞质表达菌株高37倍以上。总体而言，本研究证明了关键酶的正确定位对改善脂肪酸衍生代谢物生物合成的重要性，以及产油酵母光驱动生产可再生烃类的巨大潜力。

研究背景与问题

长链烷烃/烯烃是现代社会中不可或缺的化工原料和液体运输燃料的核心组分，传统生产主要依赖石油炼制。化石资源的不可再生性、油价波动及化石燃料消费带来的严重环境问题，推动了对可持续可再生生产路线的研究兴趣。微生物生物制造提供了一种可持续替代方案，可在温和条件下将可再生原料转化为燃料和化学品，且潜在环境影响较低。脂肪酸光脱羧酶（FAP），尤其是来自微藻Chlorella variabilis NC64A的CvFAP，已成为可持续烃类生产的有前景生物催化剂，在蓝光照射下催化游离脂肪酸（FFA）或酰基辅酶A（acyl-CoA）发生黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖的脱羧反应，碳链长度为C12至C22，生成相应烃类。然而，CvFAP催化烃类生产仍面临前体可及性有限、内源途径竞争、酶失活及长时间蓝光暴露下细胞应激等多重相互关联的挑战。

CvFAP基烃类生产的根本挑战源于其底物的理化性质。长链FFA具有极强疏水性且水溶性差（<0.1 μM），使底物转运和可及性成为酶转化的重要限制因素。在天然光合宿主中，FAP酶与富脂膜结构密切相关，脂水界面可富集疏水性脂肪酸底物并促进其与FAP相互作用。因此，FAP可被视为界面酶，其催化效率强烈依赖于与脂质界面的相互作用。这些观察提示，重建合适的富脂微环境可能是提高异源宿主中CvFAP活性的有效策略。产油红酵母Rhodotorula toruloides具有卓越的脂质积累能力，在营养限制条件下细胞脂质含量可达细胞干重的76%，其主要胞内脂肪酸均落在CvFAP底物范围内，且能利用多种碳源并耐受工业发酵条件，是实施空间工程策略的有前景宿主。脂滴（LD）由磷脂单分子层包裹中性脂质核心构成，可提供与疏水分子相互作用的脂水界面。R. toruloides中LD相关蛋白Ldp1特异定位于LD，已被用作将目标蛋白定位到LD表面的分子工具。此前已有R. toruloides胞质表达CvFAP生产烃类的报道，但将CvFAP靶向LD的尝试尚属未知。

研究内容与结论

本研究提出了整合工程策略，将LD靶向CvFAP催化、光生物过程优化和代谢重构相结合。首先通过Ldp1融合将CvFAP靶向LD以增强酶-底物共定位和胞内产物处理，随后优化蓝光发酵条件以平衡催化效率与细胞生理，最后调控脂肪酸活化、脂质周转和类胡萝卜素生物合成的关键代谢节点以重定向胞内通量。通过该协同策略，最终菌株NF72D在摇瓶培养中生产557.7 mg/L烃类，证明了空间与代谢协同对产油酵母光驱动烃类生产工程化的重要性。

关键技术方法

研究以单倍体菌株R. toruloides NP11（CGMCC 2.1389分离的单倍体）为出发菌株。主要技术方法包括：基于pZPK骨架的质粒构建与根癌农杆菌介导转化（ATMT）；CRISPR基因组编辑构建基因缺失突变体；脂滴分离结合Western blot分析验证蛋白定位与丰度；GC-MS进行脂肪酸甲酯（FAME）组成分析和烃类定量；FDA/PI染色结合流式细胞术评估细胞活力与损伤；RT-qPCR与qPCR分析转录水平及基因拷贝数；以及多孔板与摇瓶规模的蓝光发酵培养。

研究结果

3.1 将CvFAP靶向脂滴有效增强烃类生物合成

研究人员首先在NP11中异源表达密码子优化的CvFAP，蓝光照射后检测到十五烷（C15:0）、十七烷（C17:0）、8-十七碳烯（C17:1）和6,9-十七碳二烯（C17:2）四种烃类产物，两株代表性菌株NF10和NF21均生产约15.0 mg/L总烃。随后利用Ldp1通过柔性GGGS肽连接子将CvFAP融合靶向LD，6株工程菌在相同条件下烃类积累平均提高约3倍。选取NF10与NF4比较，NF4生产47.5 mg/L烃类，较NF10提高3倍以上；qPCR显示两者CvFAP基因组拷贝数与转录响应无显著差异，且表达CvFAP未显著影响细胞生长、脂质积累或脂肪酸组成，表明产量提升并非源于基因剂量、酶丰度、生长特性或整体脂质组成的改变，而可能与胞内酶组织方式变化有关。脂滴分离后Western blot显示NF4中靶蛋白在LD显著富集而NF10仅存在于胞质，且LD靶向显著增强了CvFAP在细胞中的积累。该结果支持胞内空间组织是改善脂肪酸衍生生物催化的有效工程策略。

3.2 蓝光生物过程优化平衡催化与光毒性

十七烷处理高达2%（v/v）时细胞活力仍保持90%以上，表明产物毒性不太可能是限制烃类生产的主要因素。在NL培养基中黑暗培养72 h后启动照射获得最高烃类产量56.8 mg/L，且未明显影响生长或葡萄糖消耗；12 h光/12 h暗循环维持正常生长但产量降至47.5 mg/L，表明间歇光照缓解光胁迫但减少了累积催化时间。250 μmol/m²/s照射2 d与400 μmol/m²/s照射1 d产量相近，但长时间400 μmol/m²/s导致严重色素降解、细胞漂白和活力丧失。初始OD₆₀₀较低的培养物延长的滞后期和指数期更易受光毒性影响，而较高OD₆₀₀培养物快速进入稳定期并可能在96 h前耗尽葡萄糖致产量下降，表明烃类形成与代谢活跃细胞相关。在优化条件（初始OD₆₀₀低于1.0、黑暗培养2-3 d、250 μmol/m²/s照射2 d）下，NF4和NF10产量分别增至89.7和26.7 mg/L，四种烃组分同时增加。蓝光还影响胞内脂肪酸组成，多数工程菌照射后饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸比例增加，可能反映膜重塑和氧化应激适应。

3.3 代谢工程重定向碳通量至烃类生产

研究人员靶向多个关键脂质代谢节点：过表达并靶向LD的脂肪酶Tgl5以促进脂质周转释放FFA；删除FAA1、FAA2和FAA4以减少脂肪酸活化；破坏DGA1和LRO1以减少流向三酰甘油（TAG）的碳通量；删除类胡萝卜素生物合成关键基因CRT1。其中CRT1缺陷菌株NF7效果最强，蓝光诱导后生产201.7 mg/L烃类，较亲本提高2.5倍。比较NF7与NF4发现，黑暗条件下CvFAP拷贝数和蛋白表达无显著差异，蓝光照射后两菌株CvFAP转录均显著增加且NF7更高；相同光照条件下NF7产量更高但细胞损伤和死亡率也更高，表明CRT1缺失与更强的光响应烃类生产表型相关，伴随光损伤增加和耐光性降低。增强FFA可利用性的菌株NF5、NF6、NF9脂质积累降低但在FFA含量、生物量和比生长速率上存在差异；阻断TAG合成的NF8不饱和脂肪酸比例更高。以NF6和NF7为亲本进一步组合工程获得NF64和NF72，分别生产271.3和344.9 mg/L烃类，较各自亲本提高约2.0倍和1.5倍，表明胞内通量已成功重定向至目标产物，但NF64生长较慢、脂质积累受损且不饱和脂肪酸比例降低，提示累积遗传修饰造成显著代谢负担。随后在NF64和NF72中增加CvFAP基因组拷贝数获得NF64D和NF72D，蓝光诱导后分别生产430.5和479.4 mg/L烃类，较亲本提高59%和39%；NF72D中CvFAP转录水平和蛋白丰度均显著高于NF72，表明在改善前体供应后CvFAP丰度仍是限制因素。最终50 mL规模发酵中NF72D生产557.7 mg/L总烃，包括29.7 mg/L C15:0、153.8 mg/L C17:0、194.2 mg/L C17:1和179.9 mg/L C17:2。结果还揭示了途径工程的重要权衡：增加FFA可利用性的策略通常改善前体供应但常损害生长、脂质积累或脂肪酸稳态；脂肪酸活化途径不仅是竞争性汇，也是脂质稳态和细胞适应性的重要组分。此外，工程特征相似但构建历史不同的菌株表现出不同生理与生产表型，相似修饰引入不同亲本背景有时产生相反效果，提示情境依赖性上位效应和适应性生理状态可强烈影响产油酵母代谢工程结果。

结论

本研究证明，通过协调胞内酶定位、代谢重构和光生物过程控制，可大幅提高R. toruloides蓝光驱动烃类生物合成。通过评估胞内定位策略，发现经Ldp1融合将CvFAP导向脂滴可显著增强烃类生产，凸显胞内空间组织作为脂肪酸衍生代谢物途径额外设计原则的潜力。照射时机和强度的优化进一步平衡了CvFAP催化与细胞耐光性。影响脂肪酸活化、脂质周转和类胡萝卜素生物合成的代谢干预将胞内通量重定向至烃类形成，其中CRT1缺失效果最强。进一步强化FFA供应和LDP1-CvFAP拷贝数获得菌株NF72D，在摇瓶培养条件下生产557.7 mg/L烃类。尽管产量仍较低，未来结合高细胞密度补料分批发酵、提高碳转化效率、优化光生物反应器设计以及增强流向脂肪酸衍生产物的胞内通量，将推动该平台走向工业化相关生产。