《ELECTROPHORESIS》：Exploring Elimination Profiles and Metabolite Patterns of Brinzolamide and Dorzolamide After Transdermal Exposure for Doping Control Purposes
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布林佐胺（BA）和依索唑胺（DA）是碳酸酐酶抑制剂（CAIs），通常通过局部给药用于青光眼治疗。根据世界反兴奋剂机构（WADA）禁用清单，这两种物质在赛内和赛外均被禁用，但眼科给药除外。在反兴奋剂检测中，不良分析结果（AAFs）可能不仅源于故意滥用，也可能源于
布林佐胺（BA）和依索唑胺（DA）是碳酸酐酶抑制剂（CAIs），通常通过局部给药用于青光眼治疗。根据世界反兴奋剂机构（WADA）禁用清单，这两种物质在赛内和赛外均被禁用，但眼科给药除外。在反兴奋剂检测中，不良分析结果（AAFs）可能不仅源于故意滥用，也可能源于非故意暴露或污染。尽管口服或眼部给药后的消除特征已有描述，但关于这些物质经皮肤暴露后的全身吸收和代谢行为知之甚少。因此，本研究在受控条件下考察BA和DA的经皮吸收，以表征其消除特征和代谢物模式。两组各12名志愿者在下前臂皮肤接受AZOPT布林佐胺（10 mg/mL）和TRUSOPT依索唑胺（20 mg/mL）的经皮给药，每种物质剂量为1 mg和6 mg。在给药前及给药后长达168 h收集尿液样本，并收集干血斑（DBS）样本长达3周。采用液相色谱-高分辨串联质谱（LC–HRMS/MS）分析母体化合物和选定代谢物。DBS和尿液样本中的浓度分别经血细胞比容（Hct）和尿比重（SG）校正。随后计算相对代谢物与母体比值，以描述经皮暴露后基质依赖性代谢特征。经皮给药后，BA和DA在尿液和DBS中均可检出，检测窗口随剂量增加而延长。在低剂量组中，仅4名参与者在给药后前2天内显示可检测的尿液浓度，而两种化合物在DBS中可检出长达3周。高剂量导致更高的峰值浓度和更长的可检测性。鉴定出母体化合物和N-去乙基代谢物，其可检测性和相对丰度存在基质依赖性差异。在可能导致常规兴奋剂检测中出现AAFs的浓度水平上证实了全身吸收。
**研究背景**
在体育运动领域，运动员尿液或血液样本中检出禁用物质、其代谢物或标志物可能构成不良分析结果（AAF）的分析基础，具体取决于物质类别和适用的报告标准。对于非阈值物质，物质或相关代谢物的存在通常具有决定性意义，除非该发现与获批的治疗用药豁免（TUE）或其他允许条件一致。随着分析方法灵敏度的不断提高，痕量水平检出日益频繁，反映出在以往无法检测的情况下发现微量禁用物质的能力增强。这种分析能力的提升加强了兴奋剂控制，但当禁用物质可能来源于合法治疗、使用前的远期用药或非故意暴露时，也带来了结果解释方面的挑战。
利尿剂和掩蔽剂在世界反兴奋剂机构（WADA）禁用清单的S5类别下被禁用。布林佐胺（BA）和依索唑胺（DA）是两种用于青光眼治疗的碳酸酐酶抑制剂（CAIs），在赛内和赛外均被禁用，眼科使用除外。青光眼患病率在老年人群中相对较高，因此CAIs治疗非常普遍。眼部给药后，BA和DA通过抑制睫状体中的碳酸酐酶II降低眼内压。然而，部分给药剂量可进入体循环。两种化合物对红细胞（RBCs）中的碳酸酐酶II具有高亲和力，导致优先分布于红细胞、血浆浓度低、全身消除缓慢以及在生物样本中可检测时间延长。两种药物均缓慢代谢为活性N-脱烷基代谢物，这些代谢物也在RBCs中蓄积并主要通过肾脏排泄。因此，BA和DA的检出结果可能在治疗性眼科使用停止后很长时间内持续存在。根据WADA发布的2024年反兴奋剂检测数据，DA报告了107例AAFs，占S5药物类别发生率的20%。此外，BA报告了47例AAFs，占所有S5检出结果的9%，突显了这些物质在常规兴奋剂控制中的重要性。
经皮暴露是禁用利尿剂非故意暴露的一条合理但尚未充分表征的途径。已对S5类别中几种药物的实验性经皮制剂进行了研究，表明皮肤吸收强烈依赖于药物的理化性质和使用制剂。这些研究确立了经皮递送的一般可行性。此前研究考察了BA和DA在雄性仔猪眼部给药和全身给药后的消除和代谢特征。观察到浓度特征和代谢物与母体比值的途径依赖性差异，提示代谢模式可能有助于评估暴露途径和时间。通过人体皮肤吸收及随后的代谢和消除模式尚未有研究。这一空白具有重要意义，因为若干CAI相关案例引发了对可能的局部转移或环境污染的疑问，包括接触用于动物或家庭成员的滴眼液制剂。
值得注意的是，根据现行反兴奋剂规则，运动员对样本中检出的任何禁用物质承担全部责任，无论暴露是故意的还是非故意的。运动员可能通过食品、补充剂、他人处理的药物、密切接触、共享家庭环境或污染表面接触禁用物质，这些均构成更广泛的运动员暴露组的一部分。在此类情况下，核心问题不仅是物质是否能被检测到，还包括浓度范围、检测窗口、基质分布和代谢物特征对于所声称的暴露途径是否合理。对于BA和DA，这一问题尤为重要，因为强烈的红细胞结合和缓慢消除使系统性解释变得复杂。
对于反兴奋剂研究，禁用物质经皮给药后的剂量依赖性药代动力学研究，特别是阐明生物转化和代谢模式的研究，对于评估相关申诉的合理性具有重要意义。在经皮污染可能发生的情况下，表征经皮暴露后的代谢物特征和可检测性因此具有明确的实用价值。尿液仍是兴奋剂控制中的主要基质，因为其非侵入性且方法成熟。然而，对于具有广泛血细胞结合、组织或细胞储库延迟释放以及延长肾脏排泄的化合物，尿液浓度可能难以解释。因此，对于BA和DA，即使全身暴露较低或时间上较远，尿液检出结果也可能持续存在。干血斑（DBS）采样已成为反兴奋剂分析中的补充基质，对于具有相关全血或红细胞分布的化合物可能特别具有信息价值。因此，尿液和DBS分析可为解释经皮暴露后BA和DA的检出结果提供额外背景。
据研究人员所知，除一例报告经皮暴露后尿液DA检出的单志愿者案例研究外，尚无受控人体研究考察经皮暴露于滴眼液制剂后毛细管DBS和尿液样本中BA和DA的检测情况。因此，本研究考察6名男性和6名女性志愿者经皮施用滴眼液后，尿液和DBS样本中是否能产生可检测的BA和DA结果。该研究表征1 mg和6 mg给药后的剂量依赖性浓度-时间曲线，评估两种基质中的母体化合物和代谢物，并比较尿液和DBS中的检测窗口。这些数据可通过为经皮BA和DA暴露场景提供受控人体参考信息来支持反兴奋剂结果管理。
**关键技术方法**
本研究采用液相色谱-高分辨串联质谱（LC–HRMS/MS）对尿液和DBS样本中的BA、DA及其代谢物进行分析。尿液样本经固相萃取（SPE）净化处理，DBS样本经打孔、提取和复溶处理。DBS方法按照WADA现行文件要求进行了验证，包括选择性、最低要求性能水平（MRPL）检测可靠性、检测限（LOD）、鉴定限（LOI）、基质效应、线性、回收率、稳定性和残留等参数。血细胞比容（Hct）通过近红外（NIR）光谱法非破坏性估测并进行浓度校正。此外，开展了体外红细胞-血浆分配实验以辅助解释DBS结果。人体给药研究经德国科隆体育大学伦理委员会批准（批准号214/2025），两组各12名志愿者（6男6女）前臂皮肤接受1 mg和6 mg剂量的BA和DA经皮给药，尿液样本收集至给药后168 h，DBS样本收集至3周。
**研究结果**
**DBS方法的分析性能**：在优化的LC–HRMS/MS条件下，DA和BA的保留时间分别为3.20和4.44 min。空白DBS样本中未观察到相关干扰信号。两种分析物在0.05–5.00 ng/mL范围内线性良好（R2 > 0.99）。BA和DA的LOD均估计为85 pg/mL，LOI分别为180 pg/mL（BA）和135 pg/mL（DA）。提取回收率为67%–85%，残留低于1%。自动进样器4°C储存7天后两种分析物仍可检测。
**血细胞比容对DBS分析的影响**：由于DA和BA在RBCs中的已知蓄积，Hct对结果解释有直接影响。测得的浓度被标准化为性别特异性参考Hct值（女性0.38，男性0.42）。在至少336个独立DBS样本中，Hct平均值为0.44，范围为0.37–0.54。归一化对接近参考Hct的样本影响有限，但在观察范围的极端值处产生较大调整。
**红细胞-血浆分配**：BA的红细胞/血浆响应比从0 h的1.22升至24 h的27.56。DA的比值从0 h的0.95迅速升至2 h的16.08，8 h达到最大值36.04，随后在24 h降至15.27。这些特征表明优先的红细胞蓄积，与两种CAIs对红细胞碳酸酐酶的强亲和力一致。
**尿液中BA和DA代谢物的检测**：高剂量（6 mg）后，BA和DA的SG校正尿液浓度迅速升高，在12 h达到最高平均浓度（分别为615.6 ± 283.8和756.2 ± 296.6 pg/mL）。在120 h时，BA在4名受试者中仍可检测（92.8 ± 12.5 pg/mL），DA在9名受试者中仍可检测（181.48 ± 82.9 pg/mL）。在144 h时，BA无样本可检测，DA仅2名受试者可检测。低剂量组中，仅4名参与者在给药后前2天内显示可检测的尿液浓度，BA和DA在2至20 h可检测，所有24 h样本均低于LOD。
**DBS中BA和DA的检测**：1 mg剂量后，BA平均浓度从2 h的178.5 pg/mL升至24 h的最大值553.5 ± 217.7 pg/mL。DA更早达到最大值，从2 h的126.9 pg/mL升至6 h的406.7 ± 194.1 pg/mL。6 mg剂量后，两种分析物在6 h达到最大平均浓度，BA为2768.1 ± 1138.0 pg/mL（2.8 ± 1.1 ng/mL），DA为2119.2 ± 1299.0 pg/mL（2.1 ± 1.3 ng/mL）。在480 h时，BA和DA在部分参与者中仍可定量，平均浓度分别为190.2 ± 59.5 pg/mL和112.7 ± 30.8 pg/mL。Hct校正通常降低早期DBS浓度，在浓度峰值附近校正与未校正曲线差异最大，在后期采样点两者基本趋同。
**尿液和DBS检测窗口的比较**：1 mg剂量后，两种化合物在DBS中于给药后早期和中期持续鉴定，最晚受试者特异性鉴定出现在216 h（9天）。尿液检测明显更短且变异更大。6 mg剂量后，BA和DA在尿液中分别鉴定至36 h和72 h，而1 mg剂量后尿液检出仅限于少数受试者的早期采样点（至16 h）。总体而言，DBS提供了比尿液更长且更一致的检测窗口，尤其在低剂量1 mg暴露后。
**相对代谢物与母体响应比值**：N-去乙基BA/BA和N-去乙基DA/DA比值均呈先升后降模式，6 mg剂量后最高平均比值出现在48–72 h，随后至480 h逐渐下降。1 mg剂量后，两种比值在早期阶段短暂超过0.5，随后大多保持在0.5以下。6 mg剂量后，两种比值在48–72 h达到最高平均值约1.0，然后至480 h逐渐降至约0.3–0.4。较大的误差棒表明存在显著的个体间变异。这些发现表明N-去乙基代谢物相对丰度的时间和剂量相关变化，但不能确定高剂量下代谢转化增加。
**对兴奋剂控制的实际意义及研究局限性**：本研究表明DBS可提供经皮给药后BA和DA暴露的补充证据。DBS提供微创采样并能检测全血中的循环母体化合物，而尿液仍可用于监测肾脏排泄和尿液代谢物模式。同时评估两种基质有助于区分早期尿液排泄和延长的血液可检测性，从而在给药时间不确定时改善暴露时间线和检测窗口的表征。DBS中DA和BA的峰值浓度（以及尿液中）不超过低ng/mL范围，远低于反复治疗性眼科给药或模拟眼科给药所达到的水平。根据现行WADA规定，BA和DA不应纳入最低DBS检测菜单。本研究存在若干局限性：样本量有限和显著的个体间变异限制了浓度特征和检测窗口的普适性；未采集配对静脉血样本，无法直接比较毛细管DBS与全身全血浓度；研究使用的受控经皮给药约相当于一滴和六滴眼液当量，1 mg剂量近似单滴眼液当量，可能反映低暴露场景，而6 mg剂量代表较高的受控暴露，不应解释为典型的偶然接触；未测量尿液pH值；N-去乙基代谢物无真实参考标准品，因此未使用独立基质匹配校准曲线定量。
**讨论与结论**
本研究证明经皮给药后BA和DA可在尿液和DBS中检出。DBS提供了更长且更一致的检测窗口：1 mg后BA和DA鉴定至216 h；6 mg后所有参与者在480 h时仍可鉴定，表明检测窗口至少3周。尿液中鉴定变异更大，6 mg后BA和DA分别延长至36 h和72 h，1 mg后主要发生在第一天。延长的DBS可检测性与BA、DA及其代谢物通过碳酸酐酶结合的广泛红细胞分配及全血缓慢消除一致。Hct和SG校正改变了绝对浓度估计值，但未实质性改变主要浓度-时间模式或基质依赖性检测窗口。至少336个独立DBS斑点中测得的Hct值保持在生理范围内，表明Hct相关偏倚不太可能解释观察到的剂量和时间依赖性差异，但其对DBS定量的潜在影响仍应考虑。这些发现提示皮肤接触禁用物质可能是运动员非故意暴露的合理途径。体重级别运动项目和残奥运动员中BA和DA检出结果的增加，特别是可能有眼科用药医疗需求的视力障碍运动员，值得进一步研究。需要进一步研究使用更低暴露水平和额外受控暴露场景，以确定浓度特征、检测窗口和代谢物与母体比值是否可支持BA和DA检出结果的途径特异性解释。如果未来证据证实治疗性眼科使用下利尿或掩蔽相关性有限，BA和DA在反兴奋剂结果管理中的监管处理可能值得仔细的、基于证据的重新评估。
