《Soil Biology and Biochemistry》：The illusion of diversity: sampling design drives conflicting estimates of soil bacterial richness
编辑推荐：
•土壤微生物多样性的估计结果对采样设计非常敏感•土壤混合处理显著低估了实际观测到的样地水平多样性•固定的测序深度限制了从更多土芯中检测到额外微生物类型的潜力•土壤混合处理可能会改变不同生态系统之间的多样性差异•测序工作量应随着采样工作量的增加而增加引言土壤微生物群落具有极高的多样
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土壤微生物多样性的估计结果对采样设计非常敏感
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土壤混合处理显著低估了实际观测到的样地水平多样性
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固定的测序深度限制了从更多土芯中检测到额外微生物类型的潜力
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土壤混合处理可能会改变不同生态系统之间的多样性差异
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测序工作量应随着采样工作量的增加而增加
引言
土壤微生物群落具有极高的多样性和空间异质性（Fierer & Jackson 2006; Nunan 等人 2020），这使得它们即使使用标准的野外和测序方法也容易受到采样不足的影响（Torsvik & ?vre?s 2002）。宏观生态学研究早已表明，有限的采样通常会系统性地低估真实的多样性，尤其是在以稀有或分布不均的生物为主导的系统中（Gotelli & Colwell 2001; Magurran 2021）。在土壤中，随着采样工作量的增加，观察到的微生物群落多样性显著提高（Hermans 等人 2019; Joos 等人 2020），然而即使采用密集的采样方案，也只能恢复部分存在的分类单元，这反映了土壤中存在的巨大未发现多样性（Fierer & Jackson 2006; Delgado-Baquerizo 等人 2016）。DNA提取、扩增和测序协议进一步限制了全面描述土壤微生物群落的能力，例如通过对可提取DNA的土壤量设置了上限（Jurburg 等人 2021, 2022）。因此，一个主要挑战是设计能够充分捕捉空间变异性的采样策略，并允许可靠地估计微生物多样性。
鉴于这些限制，将来自单个样地的多个土芯混合或均质化是一种常见的做法，旨在提高样地水平微生物多样性的代表性，同时降低测序成本和实验室工作量（Thompson 等人 2017; Jurburg 等人 2021）。然而，这种做法掩盖了这些群落在样地层面的空间分布。多样性估计直接依赖于采样的空间尺度，而该尺度又由样本颗粒（即所取样本的质量、体积或面积；Bach 等人 2018）、研究的范围以及样本之间的距离决定（Dungan 等人 2002; Chase 等人 2018）。在土壤中，特别是使用混合样本时，样本颗粒不是由单一参数定义的，而是由均质化的土芯数量（即采样工作量）和取样的面积（通常定义为样地）决定的。当多个土芯合并成一个混合样本时，DNA提取方案的限制通常要求每个样本使用的土壤质量相同（通常<5克），无论采样工作量如何。此外，测序深度的限制以及稀释处理的需要（Schloss 2024）导致所有样本的观察数量相等，而不考虑样地大小或采样工作量。虽然稀释处理仍然是控制测序工作量不均衡的最可靠方法之一（Weiss 等人 2017; Schloss 2024），但它无法解决由于样地大小或均质化差异引入的偏差（Chase & Knight 2013; Chase 等人 2018）。因此，预计更大的样地，特别是在采用更大努力进行采样的情况下，能够检测到更高的多样性，这与分类单元-面积的关系一致（Wiens 1989; Levin 1995; Drakare 等人 2006; Castle 等人 2019）。实际上，基于覆盖度的方法提供了一个量化采样完整性的框架，并表明要完全描述高度多样化的土壤微生物组合，理论上需要付出更多的努力（Chao & Jost 2012）。
重要的是，由于分类单元-面积的关系是非线性的（Wiens 1989; Levin 1995），均质化会通过去除构建微生物群落的细尺度空间信息而引入歧义（Ettema 2002; Castle 等人 2019）。这损害了从不同样地区域或采样努力下获得的混合样本中得出的多样性估计，并使得混合样本与单个土芯之间的直接比较变得复杂（Castle 等人 2019）。随着长期和全球性的土壤生物多样性监测工作的开展（Fischer 等人 2010; Guerra 等人 2021; Parnell 等人 2025; Singh 等人 2025），这一限制尤为重要。
尽管实验研究表明，混合土壤会降低局部多样性并减少样本间的方差（West & Whitman 2022），但其作为标准野外采样实践对土壤微生物多样性检测的影响尚未得到充分探索，特别是在不同的采样努力和样地大小下。为了评估这些方法选择如何影响土壤中的微生物多样性估计，我们在德国三个地区的57个地点采集了855个土壤样本，这些地点涵盖了草地和森林的不同土地利用强度梯度。这些长期研究站点（生物多样性探索站；Fischer 等人 2010）的土壤样本已经使用固定距离的正交样带设计进行了十多年的定期采样，每个样带上均匀分布着14个土芯。在每个地点，我们不仅采集了混合土壤样本，还采集了每个样带点的单个土芯，并根据标准协议对混合样本和单个样本进行了16S rRNA基因宏条形码分析。通过计算机模拟均质化过程，并将得到的土壤细菌群落与从物理混合样本和单个土芯中得到的群落进行比较，我们旨在量化样地大小和采样努力如何影响土壤微生物多样性的检测，并确定DNA提取和稀释处理是否在多样性检测中引入了偏差。
章节摘要
研究地点和样本收集
土壤样本来自生物多样性探索站（Fischer 等人 2010），这是一个长期研究平台，用于研究德国环境和土地利用梯度下的生物多样性和生态系统过程。这三个探索站（Schw?bische Alb、Hainich-Dün和Schorfheide-Chorin）每个包含100个地点（50个草地，50个森林），代表了不同的管理强度和环境条件。在这个框架下，有57个地点被指定为非常集约化的地点
采样努力对样地水平多样性和覆盖度的影响
为了评估采样努力如何影响每个地点观察到的微生物多样性，我们将样地水平多样性建模为采样努力（即每个地点随机选择的样本数量）的函数。在草地和森林生态系统中，样地水平多样性都随着采样努力的增加而增加（图1a；图S3）。对于来自单个土芯的单个样本，我们在森林中平均观察到了807 ± 259个自主分类单元（ASVs），而在草地中则为748 ± 134个ASVs。
讨论
多样性估计本质上受到采样方式的影响，特别是在由大量稀有分类单元主导的高度多样化组合中（Gotelli & Colwell 2001; Magurran & McGill 2011）。这对于土壤微生物群落尤其重要，因为在细小的空间尺度上，它们具有高度多样性和空间异质性，导致物种积累关系非常陡峭（Ettema 2002; Fierer & Jackson 2006; Baker 等人 2009）。其他方法学障碍还包括
CRediT作者贡献声明
Maria Kostakou：写作——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化，方法学，调查，正式分析，数据管理。Niklas Neisse：写作——审阅与编辑，调查。Kezia Goldmann：写作——审阅与编辑，项目管理，概念化。Antonis Chatzinotas：写作——审阅与编辑，项目管理。Stephanie D. Jurburg：写作——审阅与编辑，可视化，监督，资源管理，项目管理，方法学，
未引用的参考文献
Fierer, 2017; Jari Oksanen等人，2007; Nekola和White，1999; Raynaud和Nunan，2014; Tecon和Or，2017; Vos等人，2013; Whittaker，1972。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
我们感谢生物多样性探索站的管理者Max Müller、Miriam Teuscher、Franca Marian以及所有以前的管理者在维护样地和项目基础设施方面的工作；感谢Victoria Grie?meier在中枢办公室提供的支持；感谢Andreas Ostrowski管理中央数据库；以及Markus Fischer、Eduard Linsenmair、Dominik Hessenm?ller、Daniel Prati、Ingo Sch?ning、Fran?ois Buscot、Ernst-Detlef Schulze、Wolfgang W. Weisser以及已故的Elisabeth Kalko所发挥的作用
Maria Kostakou|Niklas Neisse|Kezia Goldmann|Antonis Chatzinotas|Stephanie D. Jurburg
