《Advanced Science》：SUMOylated DDX3 Promotes HBV Replication and Tumor Growth of Hepatocellular Carcinoma via TRIM28-DDX3-KLF4α Signaling Axis
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DDX3具有调控细胞增殖与抗病毒效应的双重生物学功能。本研究聚焦于SUMO化修饰介导的DDX3在乙型肝炎病毒（HBV）感染向HBV相关肝细胞癌（HBV-HCC）进展过程中的交互作用。研究人员鉴定了DDX3在四个关键赖氨酸（K）残基（K81/K208/K215/
DDX3具有调控细胞增殖与抗病毒效应的双重生物学功能。本研究聚焦于SUMO化修饰介导的DDX3在乙型肝炎病毒（HBV）感染向HBV相关肝细胞癌（HBV-HCC）进展过程中的交互作用。研究人员鉴定了DDX3在四个关键赖氨酸（K）残基（K81/K208/K215/K564）上的SUMO化与去SUMO化动态调控以响应HBV感染。在HBV急性感染早期，SENP1与DDX3相互作用维持DDX3去SUMO化状态以抑制HBV复制。在持续性HBV复制过程中，随着SENP1下调和HBV聚合酶（Pol）的积累，DDX3与SENP1解离并与TRIM28结合，后者诱导DDX3发生SUMO化。同时，SUMO化DDX3增强KLF4 mRNA的选择性剪接以生成KLF4α异构体，该异构体参与Cyclin D1介导的细胞周期进程，削弱DDX3的抑癌功能并促进HBV-HCC进展。此外，DDX3表达与KLF4 mRNA呈正相关，且DDX3高表达伴随TRIM28低表达提示HBV-HCC患者总体生存率较好。研究结果揭示了DDX3 SUMO化与去SUMO化之间的动态调控，包括介导HBV基因转录、病毒抗原分泌和细胞增殖。此外，TRIM28-DDX3-KLF4轴作为HBV-HCC的新型治疗靶点，展现出抑制肿瘤进展和阻断HBV-宿主相互作用的双重能力。
**研究背景与问题**
肝细胞癌（HCC）是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，其中约85%的中国HCC病例与乙型肝炎病毒（HBV）感染相关。尽管抗HBV疫苗已广泛应用，全球仍有约2.96亿人慢性感染HBV。慢性HBV感染可导致肝炎、肝硬化，最终诱发HBV相关肝细胞癌（HBV-HCC）。目前HBV-HCC的治疗主要包括肿瘤治疗前后的抗病毒治疗，但抗病毒治疗周期长，部分患者治疗响应不佳。因此，深入揭示HBV感染促进HCC发生的分子机制，寻找新的治疗靶点具有重要临床意义。
蛋白质翻译后修饰（PTM）在调控HBV-HCC进展中发挥重要作用。SUMO化修饰（SUMOylation）作为一种重要的PTM类型，参与调控大量蛋白质的功能和多种生物学过程。病毒可与宿主细胞的SUMO通路相互作用，促进感染、持续存在及宿主细胞恶性转化。然而，SUMO化修饰如何调控宿主蛋白在HBV感染至HBV-HCC进展转换过程中的作用尚不完全清楚。
DDX3（DEAD-box RNA解旋酶3）具有调控细胞增殖和抗病毒的双重生物学功能。既往研究表明，DDX3在HBV感染过程中扮演"双刃剑"甚至矛盾的角色：一方面作为宿主因子通过先天免疫应答抑制HBV复制；另一方面，随着HBV病毒产物在宿主细胞中积累，DDX3的抗病毒功能逐渐被削弱。然而，是什么特定因素或机制赋予DDX3在应对HBV存在时的相反作用，尚不清楚。基于此，研究人员聚焦于SUMO化修饰介导的DDX3在HBV感染与HBV-HCC进展交互作用中的调控机制，开展了系统性研究，相关成果发表在《Advanced Science》。
**关键技术方法**
研究人员主要采用了以下关键技术方法：（1）免疫共沉淀（Co-IP）结合Western blot和质谱（MS/MS）鉴定蛋白质相互作用及复合物组分；（2）免疫荧光（IF）和亚细胞组分分离检测蛋白定位；（3）SUMO化位点预测结合定点突变验证SUMO化修饰位点；（4）体外SUMO化实验验证E3连接酶对DDX3的催化作用；（5）RNA免疫沉淀（RIP）及RIP测序（RIP-seq）鉴定DDX3结合的mRNA；（6）RNA测序（RNA-seq）分析可变剪接事件；（7）HBV急性感染小鼠模型（流体动力学注射pHBV-1.3mer质粒）和HCC异种移植裸鼠模型进行体内验证。临床样本方面，使用了含90例HCC组织及配对癌旁组织的组织芯片（来自Outdo Biotech），以及来自贵州省人民医院的12例肝脏组织样本（6例HBV阳性和6例HBV阴性非癌肝组织，3例早期和3例晚期HBV-HCC肿瘤组织）。
**研究结果**
**2.1 DDX3在HCC细胞中优先与SUMO2共价结合**
研究人员通过双标记免疫荧光实验发现内源性SUMO1/2/3与DDX3在HepG2和Hep3B细胞核中共定位。免疫共沉淀实验显示DDX3可与SUMO1和SUMO2/3共价结合，形成分子量超过75 kDa的慢迁移条带。在Ubc9共表达条件下，外源性Flag-DDX3的SUMO化修饰显著增强。SUMO抑制剂ML-792（0.5 μM）处理可显著降低SUMO化DDX3水平。通过分别共转染His-SUMO1、His-SUMO2、His-SUMO3，研究人员证实DDX3在HepG2细胞中优先与SUMO2结合。
**2.2 K81/K208/K215/K564是DDX3的主要SUMO化位点**
通过SUMO化预测软件（GPS-SUMO、SUMOplot、JASSA）分析和蛋白质组数据库检索，研究人员筛选了9个候选赖氨酸残基进行定点突变验证。单点突变实验显示K81、K118、K138、K208、K215、K418和K564位点突变后SUMO化水平显著降低，但无单位点突变完全消除DDX3 SUMO化。进一步构建双位点、三位点和四位点突变体，发现DDX34KR（K81/K208/K215/K564突变为R）SUMO化水平几乎消失。体外SUMO化实验同样证实DDX34KR突变体阻断了DDX3的SUMO化修饰。
**2.3 HBV急性感染早期去SUMO化下调核内DDX3水平**
研究人员发现HBV转染可降低DDX3 SUMO化水平，且呈剂量依赖性。在HepAD38细胞（四环素调控HBV表达）中，四环素存在（抑制HBV产生）时SUMO化DDX3水平升高，无四环素时降低。病毒类似物Poly(I:C)和Poly(dA:dT)处理同样降低SUMO化DDX3水平。亚细胞组分分离实验显示HBV转染后核内DDX3蛋白随时间依赖性减少，且DDX34KR突变体主要定位于细胞质。上述结果表明HBV急性感染早期驱动宿主DDX3去SUMO化，减少核内DDX3含量。
**2.4 SENP1在HBV感染早期催化DDX3去SUMO化**
通过筛查SENP家族成员，研究人员确认SENP1与DDX3存在相互作用。DDX3的aa 1–414区域为主要SENP1结合区域。SENP1过表达以剂量依赖性方式降低SUMO化DDX3水平。SENP1催化活性位点突变体C603A虽仍可与DDX3结合，但丧失了去SUMO化酶活性。随着HBV转染时间延长，DDX3与SENP1的相互作用逐渐增强，而SUMO化DDX3水平下降，提示SENP1招募至DDX3驱动去SUMO化可能是宿主细胞在HBV感染早期的应急响应机制。
**2.5 DDX34KR在体外和体内有效抑制HBV复制**
研究人员证实DDX3可直接结合HBV复制中间体pgRNA和HBV Pol，抑制HBsAg分泌并促进IRF3磷酸化。DDX3 ATP酶/解旋酶活性突变体（K230E、S382L）不影响其SUMO化水平。DDX34KR较野生型DDX3具有更高的ATP酶活性，表明SUMO化降低DDX3的ATP酶活性。在HepG2和HepG2.2.15细胞中，DDX34KR较DDX3更有效地抑制pgRNA表达和HBsAg分泌，并更显著地增强IFN-β启动子活性和基因转录。在HBV急性感染小鼠模型中，DDX34KR较DDX3更有效地抑制血清HBsAg分泌和肝组织HBcAg表达。
**2.6 SENP1下调和HBV Pol积累协同增强HBV-HCC中DDX3 SUMO化**
研究人员发现SENP1在HBV持续复制的HepG2.2.15和HepAD38细胞中表达降低，SUMO化DDX3水平升高。在HBV阳性肝组织中SENP1表达低于HBV阴性肝组织。HBV Pol与DDX3的aa 1–414区域结合，且随HBV Pol浓度增加，DDX3与SENP1的结合减弱，表明HBV Pol积累 disrupts DDX3-SENP1相互作用。综上，SENP1下调和HBV Pol积累共同导致HBV-HCC中DDX3 SUMO化上调。
**2.7 DDX3 SUMO化促进KLF4 mRNA外显子跳跃生成KLF4α以推动HBV-HCC细胞周期进程**
研究人员发现DDX3过表达将HBV-HCC细胞周期阻滞于G1期，降低Cyclin D1表达，并抑制裸鼠移植瘤生长。通过IP-MS鉴定，DDX3相互作用蛋白富集于剪接体和RNA剪接相关通路。RIP-seq证实DDX3直接结合多种mRNA。结合MS和RIP-seq数据，研究人员聚焦于细胞周期相关转录因子KLF4，RIP实验显示DDX3与KLF4 mRNA结合显著高于KLF17和KLF13 mRNA。DDX3正向调控KLF4表达。KLF4 mRNA存在五种可变剪接变体，RNA-seq显示DDX3敲低导致KLF4 mRNA第3外显子跳跃，生成KLF4α剪接异构体。功能分析显示KLF4α定位于细胞质（KLF4wt定位于细胞核），过表达KLF4α显著促进HepG2.2.15细胞周期进程和增殖，而KLF4wt抑制细胞增殖。与DDX34KR相比，DDX3更有效地将细胞周期阻滞于G1/S期、降低Cyclin D1表达并抑制细胞增殖，且DDX34KR诱导的KLF4α剪接变体量少于DDX3。上述结果表明DDX3 SUMO化促进KLF4 mRNA第3外显子跳跃生成更多KLF4α异构体，增强Cyclin D1表达并促进HBV-HCC细胞增殖。
**2.8 TRIM28的RBCC结构域结合DDX3 N端增强HBV-HCC细胞中SUMO化DDX3水平**
通过IP-MS鉴定，研究人员在HepG2His-SUMO2细胞中鉴定到423个DDX3相互作用蛋白，其中SUMO E3连接酶TRIM28为其中之一。Co-IP验证了DDX3与TRIM28的相互作用。体外SUMO化实验证实TRIM28催化并促进DDX3的SUMO2修饰。TRIM28过表达以剂量依赖性方式增强DDX3 SUMO化水平。结构域分析显示TRIM28的RBCC结构域（aa 1–376）和RING结构域（aa 65–121）结合DDX3，而DDX3的N端aa 1–414区域与TRIM28相互作用。TRIM28通过其RBCC结构域促进DDX3 SUMO化。
**2.9 DDX3与KLF4在HCC中正相关，DDX3高表达伴TRIM28低表达提示HBV-HCC患者预后较好**
GEO数据库分析显示DDX3 mRNA在HBV-HCC组织中较癌旁组织降低。组织芯片（90例HCC及配对癌旁组织）免疫组化分析显示HCC组织中DDX3表达评分（6.71 ± 2.99）显著低于癌旁组织（9.23 ± 2.51，p < 0.01），HBsAg阳性患者HCC组织中DDX3同样显著下调。DDX3表达与肿瘤病理分级相关。HBV-HCC组织中DDX3分布于细胞核和细胞质，SUMO2主要定位于细胞核，TRIM28在HBV-HCC组织细胞核中高表达。晚期HBV-HCC患者肝组织中TRIM28表达和SUMO化DDX3水平均高于早期患者。Kaplan-Meier分析显示TRIM28高表达提示HBV-HCC患者预后不良，单指标DDX3对预后不敏感，但DDX3高表达联合TRIM28低表达提示患者总体生存较好。LinkedOmics和cBioPortal数据库分析显示DDX3与KLF4表达在HCC中呈正相关。在HBV-HCC患者外周血单核细胞（PBMC）中，DDX34KR诱导的KLF4α少于DDX3，与细胞水平结论一致。
**讨论与结论**
研究人员在讨论部分指出，SUMO化是一种关键PTM过程，作为宿主细胞抗病毒免疫应答中的快速可逆机制，调控抗病毒蛋白功能并维持感染后免疫平衡。反之，许多病毒已进化出操纵宿主SUMO化系统的策略以利于自身。HBV感染是肝癌的主要原因，抗病毒治疗可降低HCC患者术后HBV激活并延长生存，但治疗周期长且部分患者响应不佳。本研究揭示靶向蛋白SUMO化可能成为HBV-HCC的潜在治疗策略。
DDX3作为ATP依赖性RNA解旋酶，参与多种细胞生物学过程。在病毒感染的早期阶段参与先天免疫调控，并与病毒诱导的癌症密切相关。HBV进入肝细胞后，DDX3磷酸化介导IRF3招募至DDX3-IKKε复合物，促进ifnb启动子激活并抑制病毒复制。DDX3激活TBK1/IRF3免疫信号通路诱导IFN-β表达，降低HBsAg分泌。HBV Pol是病毒生命周期中的主要蛋白，识别pgRNA的5' ε茎环结构并形成复合物。抗病毒蛋白DDX3可直接结合HBV Pol，抑制病毒逆转录和复制。然而，随着HBV在宿主细胞中持续复制，大量病毒产物积累，DDX3被病毒劫持以促进自身复制。HBV Pol可干扰DDX3与IKKε/TBK1的相互作用，影响TBK1/IRF3通路，抑制IFN-β产生。本研究显示HBV Pol积累破坏DDX3与SENP1的相互作用，可能影响慢性HBV向HBV-HCC转换过程中DDX3的SUMO化水平。
PTM类型及PTM相关酶调控DDX3活性并改变其与其他蛋白的相互作用。本研究聚焦于SUMO化修饰DDX3响应HBV的机制，发现HBV感染早期驱动宿主DDX3去SUMO化。基于HBV诱导DDX3去SUMO化的结论，研究人员筛查了SENP家族，仅发现SENP1与DDX3相互作用。SENP1介导的去SUMO化对DDX3抑制HBV基因转录、HBsAg分泌和细胞周期至关重要。然而，HBV Pol积累破坏DDX3与SENP1的相互作用，且SENP1在HBV-HCC中下调。值得注意的是，HBV Pol破坏DDX3-SENP1相互作用的机制以及HBV-HCC中SENP1表达降低的机制有待进一步研究。
去SUMO化DDX3代表了一种宿主防御HBV感染的机制。病毒也改变宿主蛋白的SUMO化水平以抑制抗病毒免疫应答，调控蛋白相互作用、定位、稳定性和转录活性，最终控制病毒复制和病毒致癌过程。HBV主要表达HBx、HBcAg、HBsAg、HBV Pol和HBeAg等病毒蛋白。HBx蛋白增加LASP1 SUMO化以稳定HER2并促进肝癌发生。HBV Pol是最早发现且研究最广泛的与DDX3相互作用的HBV蛋白。本研究揭示DDX3 SUMO化水平可能受HBV Pol量影响。DDX3蛋白直接结合HBV Pol，通过抑制HBsAg分泌和促进p-IRF3表达发挥抗病毒效应。然而，HBV Pol积累破坏DDX3的抗病毒活性及其与SENP1的相互作用，导致HBV-HCC中DDX3 SUMO化上调。DDX3 SUMO化水平的这些动态变化提示其在肝炎向HCC转变中的作用。
DDX3作为抑癌基因，通过降低Cyclin D1表达和抑制HBV复制发挥作用。为探究SUMO化DDX3的调控机制，研究人员鉴定了其主要SUMO化位点。DDX3主要在K81、K208、K215和K564位点与SUMO2结合。这四个赖氨酸残基基于GPS-SUMO和SUMOsp 2.0的联合预测评分及单位点突变结果选出，单位点突变对DDX3功能影响有限。为最大化功能影响并便于表型分析，研究人员构建了组合DDX34KR突变体，该突变体降低而非完全消除DDX3 SUMO化水平。鉴于DDX3可能含有其他可被SUMO化的赖氨酸残基，其他潜在位点对DDX3功能的贡献有待未来使用功能丧失点突变系统研究。总体而言，在TRIM28催化激活下，HBV-HCC中SUMO化DDX3水平升高。DDX3 SUMO化促进KLF4第3外显子跳跃生成更多KLF4α异构体，削弱DDX3下调Cyclin D1和阻滞细胞周期的能力，促进HBV-HCC细胞增殖。
基于DDX3蛋白的重要生物学功能，本研究评估了HBV-HCC组织中DDX3表达水平及其SUMO化与患者生存预后的关联。尽管总DDX3免疫组化评分与组织病理分级仅呈弱相关，但这一观察并未削弱DDX3在HBV-HCC进展中的潜在重要性。因此，研究人员聚焦于DDX3、TRIM28和SUMO2的相互作用轴，这三个分子在功能上反映DDX3 SUMO化活性。SUMO连接酶TRIM28的表达与HCC患者肿瘤大小、肿瘤分期和5年总体生存率密切相关，TRIM28过表达患者生存率显著缩短。本研究显示晚期HBV-HCC患者肝组织中TRIM28、SUMO2和SUMO化DDX3水平均高于早期患者。DDX3高表达联合TRIM28低表达的HBV-HCC患者总体生存较好。因此，TRIM28与DDX3之间的异常相互作用可能与DDX3协同促进HCC发展，提示DDX3的SUMO化状态可能比测量总DDX3水平具有更大的预后价值。
值得注意的是，本研究采用pHBV-1.3mer质粒瞬时转染模拟早期HBV感染。尽管该系统支持高效HBV复制且已广泛用于研究病毒-宿主相互作用，但并不能完全复现完整的HBV生命周期，包括病毒进入、cccDNA形成及自然感染相关的早期宿主应答。为验证研究结果的准确性，研究人员检测并比较了不同临床背景患者肝组织（无肝炎 vs 慢性乙型肝炎，早期HCC vs 晚期HCC）中SENP1和TRIM28的表达水平。与体外观察一致，肝炎组织中SENP1表达低于非肝炎组织，TRIM28表达随HBV-HCC进展而升高。
**研究结论翻译：** 总之，本研究揭示了DDX3作为与HBV-HCC进展相关的SUMO化底物，并探索了SUMO化介导的DDX3响应HBV复制及调控HBV-HCC细胞生物学过程的分子机制。研究结果表明，靶向TRIM28-DDX3-KLF4信号轴是治疗HBV-HCC的潜在有效策略。
