基于RNA干扰（RNAi）的启动子—靶位点双控策略实现真核微生物多基因生物合成途径精细调控

《Advanced Science》：Combinatorial Tuning of Multigene Biosynthetic Pathways based on RNA Interference

　　

多基因途径表达水平的精细调节仍是真核微生物细胞工厂工程化改造中的主要挑战。对单个途径基因的修饰以及基于CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）的方法通常需要反复进行基因组重构、使用大型调控元件或复杂的向导阵列组装。在此，研究人员开发了一种轻量化的转录后RNA干扰（RNA interference, RNAi）策略，可在无需迭代基因组编辑的情况下实现基因表达的精细调节。研究人员采用按片段大小选择的小RNA测序和功能测试，鉴定出在Schizochytrium sp.中具有梯度转录强度的内源性Pol III（RNA polymerase III）启动子。将启动子强度与多个短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）靶位点组合，扩展了可及抑制范围，并实现了高分辨率基因剂量调节。研究人员将该基于RNAi的组合调控策略应用于Schizochytrium sp.的三基因类胡萝卜素途径和Yarrowia lipolytica的九基因二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid, DHA）途径，显著提高了两种宿主中的产物产量。整合RNAi筛选与剂量优化进一步鉴定并调节了旁路途径，使DHA与二十二碳五烯酸（docosapentaenoic acid, DPA）的比值较野生型提高4.50倍。这些增益在5-L发酵和连续传代中得以保持。该工作为工程化改造真核微生物宿主中的复杂生物合成途径建立了一个紧凑且可扩展的调控框架。

多基因生物合成途径的精细表达调控是真核微生物细胞工厂工程化改造中的关键难题。对单个途径基因进行修饰以及基于CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）的方法往往需要反复进行基因组重构、使用较大的调控元件或组装复杂的向导阵列；随着受调控基因数量增加，构建量、编辑效率、可用位点和基因组稳定性评估等问题进一步限制其应用，尤其难以用于缺乏高效基因编辑工具的非模式真核微生物宿主。基于此，研究人员开发了一种轻量化、可在转录后水平实施的RNA干扰（RNA interference, RNAi）组合调控策略，通过内源性Pol III（RNA polymerase III）启动子强度与短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）靶位点选择相结合，实现多基因途径表达剂量的精细调节，并在Schizochytrium sp.和Yarrowia lipolytica中验证其效果。该研究建立了紧凑、可扩展的真核微生物复杂生物合成途径调控框架，论文发表在《Advanced Science》。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员采用按片段大小选择的小RNA测序筛选候选Pol III启动子，并以增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, eGFP）靶向shRNA进行荧光 knockdown 功能验证；构建不同启动子强度与多个shRNA靶位点组合的RNAi文库，通过表型筛选和逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR, RT-qPCR）评价抑制效率；采用气相色谱和高效液相色谱分析脂质、脂肪酸及β-胡萝卜素；开展5 L补料分批发酵和连续传代稳定性评价。样本来源包括Schizochytrium sp. HX-308（CCTCC M 209059）和前期研究构建的Y. lipolytica YLPDHA02。

2.1 不同表达强度Pol III启动子的鉴定：研究人员以24 h和72 h样本进行按片段大小选择的小RNA测序，从tRNA、5S rRNA和U6 snRNA三类中筛选表达较稳定的候选启动子；再用eGFP靶向shRNA进行功能验证。结果显示候选启动子具有明显梯度抑制效率，tRNA-Gln(TTG)-1驱动抑制效率超过95%，5S rRNA-20仅约8.46%，常用hU6在Schizochytrium sp.中未能发挥作用；敲低效率在60 h和96 h较24 h下降，引入Schizosaccharomyces pombe来源的RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP）后，96 h敲低效率约提高20%。结论是测序与功能验证结合可获得不同强度的Pol III启动子。

2.2 靶位点选择与启动子强度用于精细基因表达控制：研究人员选取Schizochytrium sp.中13个脂质合成相关基因，比较固定启动子下3个靶位点及靶位点1下3种启动子强度。结果表明靶位点显著影响敲低效率但基因间差异大，CPT1敲低范围为38.3%–84.6%，DGL仅80.9%–87.9%；ORFC位点1和3的敲低效率为89.5%和85.1%，但生物量和脂质滴度分别由71.0 g L^?1、15.1 g L^?1变为89.2 g L^?1、20.5 g L^?1。启动子强度可扩展12个基因的调控范围，如ORFB和ORFC由位点组的73.1%–80.7%、85.1%–89.5%扩展至启动子组的11.9%–75.4%、63.8%–93.6%，但单独依赖位点或启动子均不能连续覆盖约1%–100%的沉默范围。

2.3 启动子与靶位点双控实现精细调控：研究人员先覆盖靶位点，eGFP表达仍呈不连续分布；随后采用9种强度启动子与6个靶位点组合的双控策略，eGFP呈现高度精细的表达梯度，优于单因素调控。将该策略用于CPT1和TGL时，双控组出现高于单控组的脂质滴度；以TGL为例，双控最大脂质滴度为88.1 g L^?1，较单控最高76.0 g L^?1提高约15.9%。在导入Scheffersomyces segobiensis来源Des9（9D）基因、可合成棕榈油酸（palmitoleic acid, POA）的POA01菌株中，对TGL进行精细调节后POA03的POA滴度达7.31 g L^?1，分别为仅位点调控POA02和不调控POA01的1.41倍和2.86倍。

2.4 RNAi介导的三基因和九基因途径组合调控：研究人员在Schizochytrium sp.中对β-胡萝卜素途径GGPPS、PSY和LCYB三基因进行组合调控；三基因双拷贝菌株CarOE的β-胡萝卜素滴度由野生型5.79 mg L^?1提高至20.5 mg L^?1。构建9种启动子与每基因6个靶位点组合的文库并筛选100个转化子，获得Car01，其β-胡萝卜素较野生型提高18.0倍、较CarOE提高5.02倍；RT-qPCR显示高产菌中GGPPS表达降至CarOE的17%–35%，PSY抑制作用较温和，LCYB为中等抑制；补料分批发酵中Car01的β-胡萝卜素滴度为CarOE的4.75倍。在Y. lipolytica九基因DHA途径中，构建6种启动子与每基因9个靶位点组合的文库，50个随机转化子中15株优于亲本，YDHAi01的DHA含量为13.2%，为起始菌株的2.88倍；多拷贝整合时，组合调控组各拷贝数下DHA滴度均显著高于未调控组，三拷贝时达593 mg L^?1，为对应未调控组的2.81倍；C16E和Δ17D在单基因与九基因背景下的敲低效率无显著差异。结论是RNAi组合策略可在不同宿主和长途径中实现有效调控并支持多拷贝增效。

2.5 旁路途径关键基因筛选与精细调控整合：针对DHA/DPA比值，研究人员分析6条相关旁路途径并筛选50个候选基因，发现单独敲低ORFC、PLD1和PEX10可提高DHA/DPA比值；随后以9种启动子强度和每基因6个靶位点对三基因进行精细调节，从100个转化子中筛选出LDPA01，其DHA/DPA比值达11.2，为野生型的4.06倍，但总脂质滴度下降。为缓解该权衡，研究人员对TGL和ACOX1进行单基因和双基因精确调控，双基因调控菌株LDPA-TA的脂质滴度恢复至野生型水平且不损害DHA/DPA比值；在5 L生物反应器中LDPA-TA的DHA/DPA比值达11.6，为野生型的4.50倍；连续传代至P20时，DHA/DPA比值、脂质滴度和靶基因沉默效率均无显著下降。结论是RNAi筛选与剂量优化整合可识别并调节旁路途径，在恢复脂质滴度的同时提高DHA/DPA比值并保持遗传稳定性。

讨论部分总结：研究人员指出，构建优良细胞工厂常需多个酶协同工作，精细调节单个途径基因表达对优化产量和限制副产物形成至关重要，但全途径表达水平的合理调节仍具挑战；现有策略多依赖反复修饰单个基因或CRISPRi/a等转录调控，受宿主调控元件库和编辑效率限制，主要适用于模式宿主。该研究建立的RNAi组合调控方法无需反复重构染色体表达盒，尤其适用于遗传操作较困难的真核微生物宿主。RNAi应用需解决宿主是否具有Dicer和Argonaute等功能组件以及shRNA能否稳定高效表达两个问题；许多真核微生物保留RNAi相关机器，且已有研究通过异源引入Dicer或Argonaute重建RNAi功能。该研究提出通过测序和基因组注释挖掘内源Pol III启动子，再经实验筛选获得不同强度启动子的宿主定制流程；在Schizochytrium sp.中，常用U6启动子效果不佳，而tRNA来源启动子驱动shRNA表达更有效。与需要多个sgRNA和复杂阵列的多重CRISPRi相比，RNAi的shRNA模块更紧凑，且在九基因途径中单基因调控动态范围与单基因背景无明显差异。该策略不依赖宿主特异基因组特征，具有跨宿主推广潜力。局限在于当前Pol III-shRNA框架主要为组成型，缺乏CRISPRi中通过控制Cas蛋白表达实现的便捷诱导开关；多个shRNA同时表达可能带来脱靶抑制、向导竞争、Dicer或Argonaute饱和及细胞适应负担，随调控基因数增加而更明显。研究结论翻译：总之，本研究建立了一个基于RNAi的转录后组合调控框架；鉴于其依赖保守的RNAi机器，该技术可能可扩展到其他真核微生物宿主，为平衡复杂途径提供了一条简单而实用的途径，并可作为现有对单个途径基因反复修饰及基于CRISPR的代谢工程策略的有价值补充。