《Scientia Horticulturae》：Encapsulated proline alleviates heat stress effects in Cleopatra mandarin by modulating physiological, redox, hormonal, and metabolic responses
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包埋脯氨酸可缓解克莱奥帕特拉柑橘（Citrus reshni Hort. ex Tan.）的热胁迫效应，其作用机制涉及生理、氧化还原、激素及代谢响应的综合调控。研究表明，受控的脯氨酸递送能够维持脯氨酸-Δ1-吡咯啉-5-羧酸（脯氨酸–P5C）稳态，避免过度的脯
包埋脯氨酸可缓解克莱奥帕特拉柑橘（Citrus reshni Hort. ex Tan.）的热胁迫效应，其作用机制涉及生理、氧化还原、激素及代谢响应的综合调控。研究表明，受控的脯氨酸递送能够维持脯氨酸-Δ1-吡咯啉-5-羧酸（脯氨酸–P5C）稳态，避免过度的脯氨酸分解代谢压力。包埋脯氨酸在激活水杨酸（SA）-脱落酸（ABA）防御响应的同时，维持了与吲哚乙酸（IAA）相关的生长信号传导。此外，包埋制剂减轻了热诱导的氧化还原失衡，并通过抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽还原酶（GR）及脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）介导的抗氧化响应增强了抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环效率。研究结果为开发新型农业抗逆制剂提供了理论依据。
**论文解读：包埋脯氨酸缓解克莱奥帕特拉柑橘热胁迫的多维调控机制**
**一、研究背景与科学问题**
全球变暖导致高温热浪事件日益频繁、强度持续增加，热胁迫（heat stress, HS）已成为制约作物生长发育和产量的关键非生物胁迫因子之一。高温破坏细胞稳态，损害膜稳定性，降低酶活性，并诱导活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量积累，进而抑制光合作用、扰乱代谢平衡。柑橘作为全球最重要的经济果树之一，其长生长周期、常绿习性及对环境波动的敏感性使其尤其易受高温危害。在常用砧木中，克莱奥帕特拉柑橘（Citrus reshni Hort. ex Tan.）虽具有较好的耐盐性和商业砧木亲和力，但其耐热性较低，因而成为研究柑橘耐热机制的理想材料。
脯氨酸作为多功能渗透保护物质，不仅参与渗透调节，还能稳定蛋白质和膜结构、调节胞质氧化还原平衡并清除ROS。然而，外源喷施自由脯氨酸在实际应用中面临有效性受限的问题，包括可利用性快速丧失、角质层穿透性差及田间条件下快速降解等。包埋技术被认为是克服上述限制的有效策略，通过二氧化硅或多糖基聚合物等基质保护生物活性化合物免遭环境降解，并调节其释放特性。该研究团队前期已在模式植物拟南芥中证实包埋脯氨酸可通过激素平衡调控和抗氧化系统强化增强耐热性，但在木本多年生作物中的效果尚不清楚。因此，本研究旨在探讨脯氨酸包埋能否通过降低高剂量下的植物毒性并增强克莱奥帕特拉柑橘的耐热性，从而比自由脯氨酸更有效。
**二、研究技术方法**
研究采用两种包埋脯氨酸制剂：无定形二氧化硅基质制剂（Si:Pro，脯氨酸负载量33.3%，包埋效率75.5%，中位粒径18.0 μm）和麦芽糊精-果胶复合基质制剂（Malt-Pec:Pro，脯氨酸负载量20%，包埋效率42.0%，中位粒径8.6 μm）。植物材料为一年生克莱奥帕特拉柑橘幼苗，购自西班牙Beniplant S.L.认证苗圃，在人工气候室中 acclimated 10天后进行实验。首先通过剂量-响应试验（10、25、50、100 mM自由脯氨酸）确定工作浓度，随后在35/28°C（昼/夜）持续30天的热胁迫条件下，比较自由脯氨酸与两种包埋制剂处理的植株响应。研究测定了气体交换参数（净光合速率A、蒸腾速率E、气孔导度gs）、氧化胁迫标志物（H?O?和丙二醛MDA）、脯氨酸及Δ1-吡咯啉-5-羧酸（P5C）含量、抗氧化酶（抗坏血酸过氧化物酶APX和谷胱甘肽还原酶GR）活性、植物激素（脱落酸ABA、水杨酸SA、吲哚乙酸IAA、茉莉酸JA）水平，并通过RT-qPCR分析脯氨酸代谢及抗氧化相关基因表达。
**三、主要研究结果**
**3.1 剂量-响应评估与工作浓度确定**
形态学、生理学和生物化学数据共同表明，10和25 mM脯氨酸处理未引起可见症状，50 mM诱导轻度胁迫症状（叶损伤指数增加、组织紧实度略降），而100 mM导致明显失绿和光合受损。内生脯氨酸和H?O?含量随外源浓度升高呈剂量依赖性增加。50 mM被确定为最大可耐受、亚植物毒性浓度，作为后续热胁迫实验的工作浓度。
**3.2 生理响应的调节**
热胁迫条件下，自由脯氨酸处理的植株气体交换参数与单纯HS处理植株相近；而两种包埋脯氨酸处理的植株表现出较低的A、E和gs值。空胶囊处理未改变气体交换参数，排除了载体本身的影响。包埋脯氨酸降低的gs和E虽限制了碳同化，但伴随更低的氧化胁迫标志物和叶损伤，提示其保护效应不依赖于光合性能的维持。
**3.3 生化响应的调节**
热胁迫显著增加植株体内脯氨酸和P5C含量。自由脯氨酸处理进一步提高了脯氨酸积累，但P5C水平与HS处理相当，表明过量的外源脯氨酸未被高效代谢而转化为P5C。相比之下，两种包埋脯氨酸处理均使植株体内脯氨酸和P5C水平低于HS和自由脯氨酸处理组，同时H?O?和MDA含量也显著降低。这说明包埋带来的保护效应并不依赖于更高的脯氨酸积累，而可能与适度递送避免脯氨酸-P5C循环过载有关。
**3.4 激素响应的调节**
热胁迫诱导SA和ABA积累，同时降低IAA水平。自由脯氨酸处理进一步强化了SA和ABA的升高，但IAA仍维持低位，表明其强化了防御激素响应而未恢复生长相关激素平衡。包埋脯氨酸处理在同样提高SA和ABA的同时，使IAA积累高于HS和自由脯氨酸处理组甚至超过对照水平，呈现ABA、SA、IAA同时积累的激素谱。该激素组合与较低的H?O?和MDA水平相一致，可能有助于在长期胁迫下维持生理功能。
**3.5 脯氨酸-P5C循环平衡的调节**
基因表达分析显示，热胁迫上调CsP5CS1、CsPDH1和CsP5CDH表达，而CsP5CR不变，倾向于P5C积累。自由脯氨酸处理上调CsPDH1和CsProT1，并伴随Csδ-OAT显著上调，导致P5C持续产生；高脯氨酸可利用性超过PDH1分解能力，P5C大量积累，可能产生线粒体ROS副产物。包埋脯氨酸处理则使脯氨酸合成和分解基因表达均低于HS和自由脯氨酸处理组，同时CsP5CR上调，与较低的脯氨酸和P5C水平一致，表明促进了脯氨酸-P5C循环的转化步骤而非净积累。
**3.6 APX-和GR相关抗氧化响应的调节**
热胁迫上调CsAPX1和CsGR2表达并适度增强APX与GR活性。自由脯氨酸处理进一步提高APX和GR活性，与CsAPX1、CsAPX2和CsGR2表达上调一致，增强了ROS清除能力。两种包埋脯氨酸处理在两个独立实验中均诱导了最强且更协调的抗氧化响应，APX和GR活性均为各实验组中最高，并伴随CsAPX1、CsAPX2、CsGR1、CsGR2和CsDHAR3的显著上调。这表明包埋脯氨酸实现了H?O?解毒与谷胱甘肽再生的紧密协同，更有效地维持了氧化还原稳态。
**四、讨论与结论**
本研究表明，在长期中度热胁迫（35/28°C，30天）条件下，包埋脯氨酸处理与克莱奥帕特拉柑橘较低的氧化损伤、特定激素浓度变化和脯氨酸相关基因表达改变以及APX和GR活性升高相关联。与自由脯氨酸相比，包埋制剂在两种独立实验系统中均更有效地降低了H?O?、MDA和P5C积累，同时维持了SA-ABA防御激活与IAA生长信号之间的平衡，并强化了AsA-GSH循环的酶促效率。值得注意的是，包埋脯氨酸的保护效果与较低的内源脯氨酸水平相关，提示其机制在于调节脯氨酸可利用性和递送模式而非单纯增加积累量。
研究结论指出，包埋技术有效改善了外源脯氨酸在木本果树中的应用效果，为在温室和田间条件下进一步评估制剂并研究脯氨酸释放和体内转运机制提供了实验基础。然而，研究也指出当前测量并未建立脯氨酸释放动力学与所观察响应之间的因果序列，激素与生化参数仅在单一时间点（第30天）平行测定，时间进程和机制研究仍是未来工作的方向。该研究为开发基于植物源包埋材料的作物耐热性强化策略提供了重要的理论依据和实践参考。
