单细胞RNA测序与空间多组学揭示小胶质细胞–血管壁细胞互作介导三七皂苷R1抗缺血性卒中的机制

《iMetaMed》：Single-Cell RNA Sequencing and Spatial Multiomics Unveil Microglia–Mural Interactions Underlying Notoginsenoside R1 Against Ischemic Stroke

　　

缺血性卒中仍是全球性临床难题。三七皂苷R1（NGR1）源自临床价值较高的中药材三七（Panax notoginseng），显示出治疗潜力，但其机制尚不明确。研究人员采用探索性单细胞RNA测序（scRNA-seq）与空间多组学（Spatial-seq/SMALDI-MSI）分析，结果提示NGR1可逆转炎症性血管壁细胞表型，从而在大脑中动脉闭塞（MCAO）模型中恢复血管功能。受此炎症表型转化启发，分析提示NGR1通过减少缺血相关小胶质细胞亚型（Adam8^hi）并扩增保护性Socs3^hi亚型，重塑小胶质细胞–血管壁细胞间通讯。RNA速率（RNA-velocity）与扩散映射（diffusion map）分析提示NGR1相关的微胶质转录状态分布向Socs3^hi状态偏移，脂质转运体Abca9被鉴定为推定驱动基因。与此一致，SMALDI-MSI显示NGR1重编程缺血脑组织的代谢谱。在小胶质细胞中敲低Abca9可在体外和体内消除NGR1的获益。NGR1直接结合FOXO1，后者调控以Abca9为功能支持组分的更广泛转录程序，从而调节小胶质细胞炎症反应。这些发现提示小胶质细胞–血管壁细胞互作参与NGR1的保护作用，并鉴定出以ABCA9为潜在功能支持组分的更广泛FOXO1相关程序作为卒中治疗的潜在靶点。

缺血性卒中仍是一道全球性临床难题，尽管血管再通策略不断进步，静脉溶栓的时间窗仍局限于4.5 h，超过半数患者无法获得及时再灌注；即便再通成功，约40%患者因缺血后微血管功能障碍而出现持续性低灌注，因此挽救微循环稳态成为治疗优先事项。现有促血管生成药物（如血管内皮生长因子）需数周方能起效，超出挽救缺血半暗带的最佳时间窗，且可能增加血管不稳定性和通透性，导致水肿与出血转化；一氧化氮供体等急性血管活性药物不加区分地扩张所有血管段，可经侧支循环造成"盗血"现象，加重半暗带低灌注。这些非预期效应凸显了依赖缺血微环境精准调控脑血流量（CBF）的必要性。三七作为中医理论中活血化瘀的经典药材，其在缺血性卒中中的临床疗效已获验证；三七皂苷R1（NGR1）是其中主要的生物活性皂苷，具有清除自由基、抑制凋亡、抑制神经炎症及改善微循环等神经保护作用，但其在单细胞与空间层面的分子机制仍存在显著知识空白。为此，研究人员整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）与空间多组学（空间转录组学与代谢组学），刻画NGR1治疗后缺血脑组织的细胞特异性改变，揭示小胶质细胞–血管壁细胞互作在NGR1神经保护作用中的重要性，并鉴定以ABCA9为功能支持组分的更广泛小胶质细胞FOXO1相关程序作为脑缺血中CBF调控的潜在治疗靶点。

在技术方法上，研究人员采用大脑中动脉闭塞（MCAO）模型小鼠，腹腔注射NGR1（15、30、60 mg/kg）并以依达拉韦（4 mg/kg）为阳性对照，通过TTC染色、神经功能缺损评分、HE、Nissl与TUNEL染色及7天生存曲线评价神经保护效应；对假手术组、MCAO组与NGR1组（30 mg/kg）缺血半球行scRNA-seq，每组3只小鼠组织混合构建一个文库，同时取相邻冠状脑切片分别进行Spatial-seq与扫描基质辅助激光解吸/电离质谱成像（SMALDI-MSI）。数据分析采用Seurat、Harmony、DoubletFinder质控与聚类，CellMarker数据库注释细胞类型，并以独立小鼠MCAO单核RNA测序数据集行伪批量相关性验证；采用Cell2location进行空间反卷积推断区域细胞丰度，destiny包行扩散映射，scVelo行RNA速率分析，CytoTRACE评估分化潜能，CellChat推断细胞间通讯，clusterProfiler行基因集富集分析（GSEA）。机制验证方面，在HMC3小胶质细胞与MBVP血管周细胞中行氧糖剥夺（OGD）处理、siRNA敲低、胶原凝胶收缩实验与蛋白免疫印迹，在Cx3cr1-CreERT2小鼠中经AAV2/MG1.2-DIO-mCherry-shRNA实现小胶质细胞特异性Abca9或Foxo1敲低及FOXO1过表达，采用生物层干涉术（BLI）检测NGR1与FOXO1结合，并行分子对接与分子动力学模拟。

研究结果方面，第一，整合单细胞RNA测序与空间转录组学验证NGR1抗缺血性卒中的神经保护作用：NGR1剂量依赖性缩小脑梗死体积、改善神经功能缺损，疗效与依达拉韦相当，并减少缺血半球神经元丢失与半暗带凋亡细胞、提高7天生存率；scRNA-seq共获得37,212个细胞，鉴定15种细胞谱系，缺血损伤伴随细胞比例改变，其中血管壁细胞、脉络丛细胞、小胶质细胞与少突胶质细胞比例在NGR1作用下向假手术模式偏移；空间反卷积提示NGR1相关兴奋性神经元丰度增加，半暗带炎症程序评分在NGR1组降低；通路富集显示MCAO后炎症反应与细胞死亡通路富集，而NGR1后炎症与小胶质细胞活化及肌动蛋白相关通路富集；血管壁细胞中2,787个MCAO改变基因有1,530个在NGR1后反向变化，且其血管收缩与血管稳态模块的反向偏移幅度最大，故优先聚焦血管壁细胞。第二，NGR1重编程缺血后血管壁细胞表型以恢复血管稳态：RNA速率分析显示血管壁细胞状态空间分为三个分支，分支1（Myl6、Crim6高表达）代表稳态收缩性，分支2（Plaur、Pim1、Tnfaip3高表达）与炎症相关，分支3（Rem1、Klhl23、Myo1b高表达）与血管重塑相关，假手术与NGR1组主要分布于分支1和3，而分支2在MCAO组显著富集；扩散映射的损伤–稳态轴上NGR1处理细胞向假手术样状态偏移；GSEA显示NGR1上调收缩与血管重塑通路、下调炎症反应通路；血管壁细胞再聚类为血管平滑肌细胞（VSMCs）与血管周细胞，二者均呈现NGR1相关炎症表型逆转，血流调控相关亚群（周细胞Acta2^hi、VSMC Pln^hi）增加而促炎亚群（周细胞Ccl2^hi、VSMC Cxcl2^hi）减少；体外胶原凝胶收缩实验显示NGR1缓解OGD所致MBVP过度收缩，体内NGR1增加血管周围α-SMA阳性平滑肌细胞覆盖面积，激光散斑成像显示NGR1显著改善MCAO后半暗带CBF。第三，NGR1重编程缺血后小胶质细胞表型及小胶质细胞–血管壁细胞互作：小胶质细胞再聚类为11个亚群并归为4个亚系，P2ry12^hi主要见于假手术组，MCAO伴促炎Ctla2a^hi亚群增加，缺血相关Adam8^hi亚群在假手术组几乎缺失并具迁移、炎症与吞噬多功能特征，Socs3^hi亚群高表达Socs3、Nr4a1、Nfe2l2与Maff，被认为发挥抗炎抗氧化作用；NGR1使P2ry12^hi、Ctla2a^hi与Adam8^hi比例向假手术模式偏移并扩增保护性Socs3^hi亚群；CellChat显示NGR1双向纠正缺血相关通讯异常，减少病理增强信号并恢复MCAO抑制的通讯；Socs3^hi与血管壁细胞经Sema6a-Plxna2、Icosl-Cd28、Gas6-Mertk等配受体对通讯，Adam8^hi则经Spp1-Cd44、Spp1-(Itgav+Itgb5)等通讯，NGR1逆转缺血所致这些通讯失调；RNA速率与扩散映射提示缺血使小胶质细胞转录趋向促炎终末状态Adam8^hi，而NGR1组呈相反方向并向Socs3^hi偏移，CytoTRACE提示Socs3^hi为相对转录状态排序的最末端。第四，NGR1通过涉及ABCA9的FOXO1相关程序重编程缺血后小胶质细胞表型：RNA速率鉴定的Socs3^hi状态推定驱动基因中Fosb居首但因广泛应激反应不适于机制优先，Abca9居第二且在P2ry12^hi与Socs3^hi状态高表达、在Adam8^hi状态低表达，Abca9表达与稳态模块评分正相关、与促炎及Adam8^hi特征评分负相关，故选定Abca9深入研究；SMALDI-MSI显示NGR1使MCAO所致磷脂酰胆碱（PC）与溶血磷脂酰胆碱（LPC）相对离子强度改变向假手术模式偏移、降低溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）强度并增加胆固醇代谢物胆固醇酯强度，区域依赖性脂质谱改变亦被观察到；HMC3细胞中敲低Abca9可消除NGR1对OGD诱导IL-1β表达的抑制，在HMC3–周细胞共培养中敲低小胶质细胞Abca9可逆转NGR1对周细胞收缩的抑制；小胶质细胞特异性敲低ABCA9可逆转NGR1在MCAO模型中的保护作用，表现为梗死体积显著增大与神经功能缺损加重；分子对接与分子动力学模拟提示NGR1与FOXO1潜在直接结合，模拟中NGR1构象虽显著变化但整体空间结构稳定于0.45 nm内，回转半径波动小（ΔRg < 0.2 nm），NGR1与FOXO1间稳定形成2–3个氢键，溶剂可及表面积（SASA）维持约11.4 nm²，范德华力为主要互作能量（稳定时约?105 kJ/mol）；BLI验证NGR1与FOXO1直接结合，平衡解离常数（KD）为1.023 μM；敲低Foxo1可消除NGR1在OGD后HMC3细胞中的抗炎作用及对ABCA9上调的促进；小胶质细胞特异性敲低Foxo1抑制缺血半暗带ABCA9表达并加重缺血损伤（半暗带CBF进一步降低、梗死体积显著扩大），而FOXO1过表达则提升ABCA9水平、促进半暗带CBF恢复并大幅缩小梗死体积。

讨论部分指出，本研究通过单细胞与空间多组学解析NGR1在缺血性脑损伤中的神经保护机制：整合分析提示NGR1恢复缺血组织推断的兴奋性神经元丰度，与行为学恢复及免疫组化所示的广泛神经保护一致；scRNA-seq与Spatial-seq均提示血管壁细胞是NGR1神经保护效应的关键贡献者，且NGR1不仅调节血管壁细胞收缩特性，还重编程其表型状态，超越现有认识；鉴于血管壁细胞遍布脑与外周血管，全身药理靶向存在脱靶风险（如脑盗血现象），而小胶质细胞作为脑内特化免疫细胞，NGR1对其发挥双重调控，CellChat提示NGR1相关恢复被缺血破坏的两群细胞间通讯网络，缺血相关Adam8^hi小胶质细胞亚群可能是驱动血管壁细胞炎症转换的关键微环境编排者，RNA速率与CytoTRACE分析提示NGR1相关小胶质细胞转录状态由促炎状态向抗炎Socs3^hi表型重塑，Abca9为关键推定驱动基因；NGR1与FOXO1作用导致ABCA9转录上调，ABCA9作为胆固醇转运体其神经炎症背景下的生物学功能此前基本未被探索，小胶质细胞Abca9沉默可消除NGR1对共培养周细胞过度收缩的抑制作用，空间代谢组与RNA速率分析提示ABCA9水平升高与胆固醇代谢物等抗炎脂质相对离子强度升高相关；FOXO1在中枢功能尚不明确，本研究发现敲低FOXO1减弱NGR1在小胶质细胞中的抗炎效应，提示其为小胶质细胞功能调节因子。作者同时指出多项局限：scRNA-seq缺乏独立文库水平生物学重复，每种条件仅一个文库，组间动物变异无法评估，相关细胞组成、基因表达、转录状态组织及预测细胞通讯差异应解释为探索性或描述性并需独立重复验证；Iba1亦可表达于浸润性及其他脑相关髓系细胞，Cx3cr1-CreERT2系统可能靶向其他CX3CR1谱系群体，不能完全排除非小胶质细胞髓系细胞贡献，Abca9 shRNA的序列依赖性脱靶效应亦不能完全排除；体内未正式排除NGR1的血管壁细胞内在效应，培养周细胞中的直接效应提示小胶质细胞依赖与血管壁细胞内在机制可能共同参与其血管作用，故当前发现支持小胶质细胞ABCA9依赖的免疫调节为贡献性机制而非唯一调控者；FOXO1调控更广泛转录程序，调控子分析未支持缺血条件下独特的FOXO1–ABCA9选择性关系，且未行Abca9过表达或回补及FOXO1–ABCA9遗传上位实验，故将Abca9解释为更广泛NGR1响应性FOXO1相关程序中功能支持组分而非FOXO1唯一选择性下游效应器；Spatial-seq空间分辨率与采样密度有限，每个位置约100个细胞且每张切片仅采样20个位置，Cell2location提供模型推断的区域丰度估计而非直接细胞计数，未行基于标志物的兴奋性神经元独立定量，Spatial-seq与SMALDI-MSI在相邻切片进行故为互补而非直接共定位证据，SMALDI-MSI基于相对离子强度而非绝对代谢物定量，未来需靶向LC-MS/MS验证；ABCA9下游分子机制尚未阐明，特定转运脂质种类、脂质流与下游信号通路未直接检测；机制与多组学分析限于MCAO后24 h，所鉴定的响应代表急性期，不能确立其在后期恢复中的持续性或功能相关性；主要机制与多组学发现源于小鼠模型与永生化人胚胎细胞，未在人神经血管系统或卒中组织验证；30 mg/kg腹腔注射为实验疗效剂量而非已确立的最佳或可临床转化方案。结论部分译为：综上，通过整合单细胞与空间多组学，本研究支持NGR1作为一种抗缺血损伤的多功能药物，通过以ABCA9为功能支持组分的更广泛小胶质细胞FOXO1相关程序，架起减轻神经炎症与稳定血管之间的桥梁；这些发现不仅为源自临床价值药材的主要活性成分NGR1的机制提供了单细胞分辨率的见解，也为脑缺血背景下精准CBF调控提供了潜在治疗靶点。