高温与干旱共同塑造两种Populus deltoides × Populus nigra基因型的气孔导度动态

《Plant Stress》：High temperature and drought shape stomatal conductance dynamics in two Populus deltoides?×? Populus nigra genotypes

　　

气孔通过调节开闭来调控植物与大气之间的气体交换，从而在土壤水分亏缺和高温等环境变化下平衡水分损失与碳同化。然而，这些环境胁迫对树木生长及与光合作用和气体交换相关的生理生态参数（如气孔）的影响多被分别研究，尽管它们在自然界中常同时发生。研究人员以两种Populus euramericana基因型为材料，在可控生长箱中先于环境气温下施加土壤水分亏缺处理，随后施加高温处理。测定了叶片气体交换及气孔导度（g_sw）对光照强度和蒸汽压亏缺（VPD）变化的动态响应，并评估了与气孔响应相关的生理和形态性状。在高温条件下，气孔表现出两步（双峰）响应，其特征为g_sw先下降后恢复。两种基因型在光照和VPD驱动下的g_sw动态存在轻微差异，尤其在高温事件之后。更快速的气孔响应似乎与气孔形态无关。研究结果揭示了复合胁迫下水分损失与碳获取之间的权衡关系。

研究背景方面，杨树是速生树种，其生长高度依赖非生物因子，尤其是土壤水分有效性。在气候变化背景下，干旱事件频率增加可能显著影响杨树生产力并增加森林死亡风险，尤其是当蒸汽压亏缺（VPD）和高温等其他胁迫同时发生时。由极端干旱事件导致的树木死亡已有较好研究，包括对栓塞脆弱性的研究，但研究人员对树木响应高温与干旱复合事件的认识仍处于起步阶段。Populus euramericana杂交种是欧洲栽培最广泛的杨树之一，考虑到杨树的遗传多样性，筛选耐水分亏缺的基因型是可能的。由于生物量生产取决于碳获取，而水分亏缺主要是水分损失的问题，这种耐受性的关键在于植物如何通过气孔在叶片水平平衡二者。气孔是叶片表面的微小孔洞，通过开闭精细调控植物与大气之间的气体交换，促进CO₂吸收用于光合作用，同时最小化蒸腾水分损失。当环境变干（VPD增加、土壤水分有效性降低）时，气孔倾向于更快速关闭，限制水分损失，但以降低碳同化为代价。气孔关闭的调控信号通路主要由脱落酸（ABA）信号通路介导。这些气孔调节改变了碳获取与水分损失之间的平衡，反映在水分利用效率（WUE）上。在高温条件下，气孔导度可能降低或增加，通过蒸发冷却参与叶片温度调节。然而，由于VPD随温度升高而增加，难以理解温度对g_sw的直接效应。近期研究试图通过实验控制VPD来区分这些效应，发现了温度阈值。此外，气孔导度已成为从叶片尺度到全球尺度模型的核心参数，但模型基于简化假设：g_sw的环境驱动因子常被视为独立作用，且g_sw被假定瞬时达到稳态，而气孔对VPD和光照波动的响应因环境胁迫而异。因此，理解波动环境条件下的气孔响应对筛选具有改善WUE的基因型至关重要。已有研究提出叶片热调节受气孔对波动光照响应速度的影响。据研究人员所知，高温胁迫下气孔导度动态的直接证据仍然缺乏，部分原因是难以在高温下测量叶片气体交换而不混淆VPD诱导的气孔响应和仪器相关问题。近期工作揭示了Populus euramericana基因型在非生物胁迫下的差异，其中Carpaccio和I214已被广泛研究。在最优条件下，I214的g_sw和蒸腾效率（TE）高于Carpaccio，而在水分亏缺条件下，Carpaccio的TE提高而I214下降。研究人员前期工作表明水分亏缺降低了两种基因型的g_sw，但其气孔导度动态响应存在差异。气孔形态似乎影响响应速度，较小的气孔可能比较大气孔开闭更快。影响这些动态的形态因素包括气孔大小（SS）、密度（SD）和形状。此外，温度升高可能进一步改变气孔形态和解剖结构。尽管具有生态生理相关性，气孔导度动态、气孔导度和蒸腾效率之间的关系仍未解决。研究人员假设更快速的气孔响应减少快速环境波动期间的水分损失，且气孔形态影响气孔响应动态。为探究复合非生物胁迫下气孔形态、动态和水分利用效率之间的相互作用，研究人员将两种 previously characterized for their contrasting responses to water deficit 的Populus euramericana基因型（Carpaccio和I214）在气候控制箱中于充分供水或水分亏缺条件下培养，先在中等温度后在高温度下，评估叶片水平生理性状、气孔形态、稳态气孔导度以及气孔对光照强度和VPD变化的动态响应，以回答以下问题：（a）气孔如何分别及组合响应水分亏缺和高温，这些响应如何转化为生长和蒸腾效率等整株过程？（b）气孔形态是否与气孔响应速度相关？（c）高温是否影响气孔开闭速度，这些响应是否与水分损失和碳获取相关？

研究人员开展了以下研究：以两种Populus deltoides × Populus nigra（Moench.）基因型Carpaccio和I214的克隆插条为材料，种植于10 L盆中，基质为泥炭:沙（50:50，v/v），添加缓释肥料和CaMg(CO₃)₂。每基因型60株，在可控生长箱中生长50天，光周期14 h，光合光子通量密度（PPFD）350 μmol m^?2 s^?1，日/夜温度25/20°C，日/夜相对空气湿度75/65%，日/夜VPD_air 0.8/1.1 kPa。土壤含水量维持在田间持水量。为减少土壤水分蒸发，每盆土表覆盖白色大理石砾石。实验期间总水分损失的仅3%由土壤水分蒸发造成。选取大小一致的96株植物分布于8个植物生长箱，环境条件与初始生长箱相同。适应7天后，随机分配至充分供水（WW）或水分亏缺（WD）处理。土壤含水量（SWC）通过称重盆监测并用时域反射仪（TDR）校准。WD处理中，体积SWC用无线预校准探头连续监测。WW处理中，土壤湿度维持在80%相对可提取水（REW）。REW由体积SWC估算，公式为：REW_soil = ((SWC ? SWC_{wilting point})/(SWC_{field capacity} ? SWC_{wilting point})) × 100%，其中SWC_{wilting point} = 3%，SWC_{field capacity} = 42%。WD处理中，停止供水直至土壤达到30% REW，耗时3天。此后所有盆每天灌溉3–4次以维持目标REW值。8天后，所有生长箱日间温度升至36°C，在3小时升温期内VPD_air维持在1.5 kPa，持续7天。研究结论为：两种基因型均表现出对高温的双峰响应，无论是否施加水分亏缺，其特征为初始显著气孔关闭后重新开放。研究人员还证明复合胁迫条件下两种基因型的气孔开放速度均大幅增加。然而，基因型在气孔关闭动态上存在差异，I214表现出明显快于Carpaccio的响应。研究人员提出气孔导度动态可能有助于环境相关胁迫组合下水分保持与叶片热调节之间的权衡。这些发现应在更广泛的基因型范围内验证，以进一步探究气孔导度动态、蒸腾效率和生产力之间的潜在联系。此外，田间条件在环境变异性、树龄以及胁迫事件的持续时间和严重程度方面与受控实验条件存在显著差异。因此，田间验证对于评估研究发现对具有增强生产力和复合胁迫耐受性的基因型育种和筛选的适用性至关重要。

在技术方法方面，研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用便携式光合监测系统（Li-6200）测定净CO₂同化速率（A）和气孔导度（g_sw,62），并计算内在水分利用效率（WUE_i = A/g_sw,62）；使用三台校准的Li-6400XT和两台Li-6800便携式光合监测系统记录不同光照和VPD条件下的气孔导度响应曲线；采用气孔计（Li-600）每日监测气孔导度（g_sw,60）；利用Vialet-Chabrand等（2013）的S型模型拟合气孔响应曲线，估算气孔延迟（λ）、时间常数（τ）、最大响应速度（Sl_max）和达到95%响应所需时间（T₉₅）；通过扫描电子显微镜（ΣIGMA-VP）在700×放大倍数下获取气孔图像，使用ImageJ软件测量保卫细胞长度（GCL）、宽度（GCW）和面积（A_GC），计算气孔密度（SD）和气孔孔面积指数（SPI）；利用深度学习模型（StomataPy）训练气孔图像。样本队列来源为法国Nancy的Université de Lorraine, AgroParisTech, INRAE, SILVA实验室培养的两种Populus deltoides × Populus nigra基因型（Carpaccio和I214）克隆插条。

研究结果方面，第一，水分亏缺在中等和高温下对杨树生长的影响：在25°C时，水分处理（WT）对两种基因型的叶、茎或总干物质（DML、DMS、DMT）均无显著影响。然而在36°C处理7天后，I214在水分亏缺（WD）下比充分供水（WW）下总干物质积累少25%，部分由于叶片干物质积累低20%和根系干物质积累低40%。根系生长的更大分配也反映在根冠比（R/S）上，I214在36°C时最高（R/S = 0.68）。茎直径在两种基因型的WW和WD之间无显著差异，但I214在25°C和36°C下茎直径均大于Carpaccio。到高温处理结束时，WT（P < 0.001）和基因型（G）（P = 0.003）对株高有显著影响。在36°C WD下，I214比Carpaccio矮7%。叶面积质量（LMA）在25°C WD下Carpaccio最高（79.53 g m^?2），但在36°C下无显著基因型差异。Carpaccio在25°C和36°C下叶片数均多于I214。在25°C时，两种基因型的WW和WD之间叶片数无显著差异。在36°C时，WD降低两种基因型的叶片数，I214在WD下叶片数比WW少50%。第二，水分亏缺对水分利用和蒸腾效率的影响：在25°C时，WU存在显著的基因型×水分处理互作（P < 0.017），I214在WD下用水少于Carpaccio（分别为2.3和2.8 kg），导致更高的蒸腾效率（TE，11.62 g kg^?1 H₂O）。在36°C时，Carpaccio在WW下WU最高（13 kg），比I214多约2 kg。在WD下，高温期两种基因型WU均降低30%，I214耗水（6.6 kg）少于Carpaccio（9 kg）。在36°C WD下，两种基因型TE均显著增加。第三，水分亏缺对气孔导度和内在水分利用效率的影响：在WW条件下，g_sw,60在整个实验过程中逐渐下降，这是由于监测叶片上方年轻叶片持续生长和扩展导致的自遮荫增加。实验开始时（第0天），Carpaccio的g_sw,60值低于I214（0.36 ± 0.02 vs 0.46 ± 0.03 mol m^?2 s^?1，P < 0.01）。水分亏缺期开始时，WW和WD植物之间或基因型之间g_sw,60无显著差异。随后，WD下g_sw,60下降比WW下更快。Carpaccio的下降更明显且比I214早2天开始。当温度升高时（第16天），WD下g_sw,60显著低于WW。在36°C约4天后，气孔导度开始恢复至高温期前记录的值。净CO₂同化（A）和气孔导度（g_sw,62，Li-6200测定）用于计算各处理下WUE_i。A对温度响应显著（P < 0.001），36°C时最低。g_sw,62存在显著的基因型×水分处理×温度互作（P < 0.01）。在25°C时，Carpaccio WD下g_sw,62显著低于WW，但I214无此差异。在36°C时，两种基因型WD下g_sw,62均显著低于WW，I214降低81%，Carpaccio降低55%。因此，Carpaccio在25°C WD下WUE_i增加，但36°C下未增加。I214在25°C下WUE_i不受WD影响，然而当WD与高温复合时，I214的WUE_i增加69%，达到实验中记录的最高值（58.1 μmol mol^?1）。第四，Carpaccio和I214叶片的气孔形态：两种基因型的成熟叶片在水分亏缺期开始前均已完全成熟，WD对任何形态参数均无显著影响。两种基因型下表面气孔密度（SD）均高于上表面。两种叶表面I214气孔密度均高于Carpaccio。因此，I214的气孔孔面积指数（SPI）更高，下表面和上表面分别为14.6和9.0，而Carpaccio分别为11.1和7.6。考虑所有处理条件的基因型均值，Carpaccio上表面气孔大于下表面（GCL，30.1 μm vs 28.4 μm，P < 0.01；GCW，18.3 μm vs 16.4 μm，P < 0.001），上表面气孔面积也更高（A_GC，405.8 μm² vs 338.2 μm²）。相反，I214的气孔大小和气孔面积在上下表面之间无显著差异。高温下两种基因型保卫细胞宽度（GCW）均降低（P < 0.001），Carpaccio在25°C WW与36°C WW之间叶表面平均GCW显著降低。温度也影响保卫细胞面积（A_GC），基因型平均降低9%。在WW条件下，随着温度升高，Carpaccio总叶A_GC（下表面和上表面之和）降低14%，I214降低6%。在WD条件下，仅在I214高温下观察到总叶A_GC降低11%。这些温度诱导的变化可能反映影响气孔开度的气孔调节。第五，水分亏缺和温度对暗诱导关闭的影响：气孔关闭曲线通过便携式光合系统（Li-6400XT和Li-6800）叶室中光照和VPD变化评估。气孔关闭幅度（Δg_sw,cl）存在显著基因型×水分处理互作，25°C下仅在I214中观察到WD下降低（P < 0.01）。WW Carpaccio中36°C下滞后时间（λ）短于25°C（P < 0.001）。此外，Carpaccio中36°C下最大关闭速度（Sl_max）高于25°C，降低了时间常数τ。因此，Carpaccio 36°C下达到95%关闭所需时间（T₉₅）短于25°C。相反，I214在高温、水分胁迫或其组合下τ无变化，尽管36°C WD下Sl_max较25°C WW和WD增加。36°C WD下Sl_max的增加与25°C相比T₉₅显著降低相关。第六，水分亏缺和温度对光诱导气孔开放的影响：在25°C WW条件下，I214气孔开放幅度（Δg_sw）高于Carpaccio。然而，其他处理中两种基因型无显著差异。在25°C WD条件下，I214的滞后时间λ比WW高44%。对于I214，36°C WD下最大气孔开放速度（Sl_max）最高。36°C WD下Sl_max的增加与25°C WD相比时间常数τ减半相关。因此，在WD下，I214在36°C下打开气孔所需时间（T₉₅）比25°C少38%。在Carpaccio中，与25°C WD相比，复合处理下Sl_max增加且τ降低。然而，尽管Sl_max增加，T₉₅无显著变化。第七，水分亏缺和温度对VPD诱导气孔关闭的影响：气孔对VPD升高的动态响应分析显示，基因型间气孔关闭幅度Δg_sw（P < 0.01）和T₉₅（P < 0.001）存在显著差异。I214表现出较低的Δg_sw（0.23 mol m^?2 s^?1）和较短的T₉₅（45 min）相比Carpaccio。此外，25°C下WD导致Carpaccio T₉₅总体降低66%。这种更短的响应时间由WD下低得多的Δg_sw解释。因此，Carpaccio WD下τ低46%。在25°C WW条件下，I214的λ高于Carpaccio。在25°C下，I214 WD下λ和Δg_sw高于WW。由于Sl_max在WD下也降低，25°C WD下I214的T₉₅无差异。在复合处理下，Carpaccio的T₉₅较25°C WD增加。相反，I214中T₉₅无显著变化，尽管36°C WD下Sl_max较25°C WD增加50%。

讨论部分总结如下：第一，水分亏缺和温度在叶片至整株尺度的影响。研究人员表征了Carpaccio和I214在中等水分亏缺、高温及二者复合下的生理性状和气孔导度动态。先前研究已确定I214为水分亏缺敏感基因型。鉴于气孔是气体交换的主要调节者，特别是与蒸腾相关，它们通过叶片蒸发冷却减轻高温伤害。相反，在水分有限条件下，气孔关闭以减少水分损失，导致相反的生理策略。本研究目的之一是确定高温下气孔响应是否在水处理和基因型间存在差异。研究人员发现25°C下杨树对水分亏缺的基因型特异性响应证据。尽管遮荫效应导致g_sw下降，但影响两种水分处理，且由于比较在每天处理间进行，该趋势不影响观察到的处理差异。在Carpaccio中，水分亏缺下气孔导度（g_sw）显著降低，导致内在水分利用效率（WUE_i）显著增加。在I214中也观察到气孔关闭，尽管差异不显著。这些结果与先前报道两种基因型水分限制对g_sw影响的研究一致。高温4天后，研究人员发现I214在水分亏缺下WUE_i上升，由于g_sw下降大于A下降。然而，这仅代表一次时间测量而非整个时期。温度对气孔导度的影响复杂且取决于基因型和水分状态。在36°C期间，水分亏缺植物表现出气孔导度的双相响应，其特征为g_sw初始降低后恢复阶段。恢复阶段可能有助于增加叶片蒸发冷却，使植物维持叶片温度在可耐受范围内。基因型间差异在恢复阶段显现。I214在复合处理下将g_sw恢复至36°C WW植物相同水平，而Carpaccio在复合处理下g_sw仍显著低于36°C WW植物，表明Carpaccio在复合处理下持续的水分保持策略。此外，气孔重新开放更可能在I214中维持蒸腾冷却，而Carpaccio似乎在复合处理下优先水分保持。先前研究报道了不同树种对高温的对比气孔响应，从Populus euramericana中g_sw增加，到Populus simonii 40°C下气孔关闭，或Quercus极端温度下无可检测响应。本研究结果补充了这一证据体系，鉴定了Populus deltoides × Populus nigra中高温双相气孔响应，在充分供水和水分亏缺条件下均发生。观察到的双相响应，即使在充分供水植物中也以气孔导度下降开始，与通常报道的高温下气孔开放刺激形成对比。在此背景下，研究人员提出气孔导度的短暂降低反映气孔对快速温度升高的缓慢适应阶段，期间保卫细胞信号和离子运输暂时失稳。随后g_sw恢复可能涉及温度敏感的、不依赖光合的途径，包括光otropin介导的质膜H⁺-ATPase激活、通过水通道蛋白上调增加水力导度，以及角质层脂质组成的改变促进热胁迫下气体交换。此外，鉴于无论土壤水分有效性如何均观察到气孔对高温的响应，波动光照或VPD条件下的气孔导度动态值得进一步研究。气孔导度动态与水分利用效率之间的联系迄今仅在叶片水平以WUE_i形式展示。研究较长时间热暴露下的气孔响应将有助于确定这些响应是否影响整株蒸腾进而影响TE。高温条件下较慢的气孔运动，特别是白天，可能增加水分损失并可能降低整株水平水分利用效率。这一假设得到研究人员观察到的25°C至36°C期间TE下降的支持，特别是水分损失超过生物量增加。高温条件下两种基因型净光合均下降（P < 0.001），而g_sw仅在I214复合胁迫下显著降低（?81%）。这导致I214 WUE_i增加69%。未来监测净CO₂同化动态的研究有助于确定胁迫条件是否诱导气孔导度与光合之间的解耦。这一假设进一步得到热处理期间观察到的双相气孔响应的支持，其特征为初始下降后恢复。第二，温度升高诱导气孔导度动态响应变化。在25°C充分供水条件下，I214气孔对光照降低的关闭比Carpaccio更快，与先前观察一致。在高温暴露后，WW和复合处理下，Carpaccio加速了对高光至低光转换的气孔关闭，而I214仅在复合处理下增加Sl_max。Faralli等（2022）在葡萄中报道了类似行为，强调气孔导度动态在热胁迫耐受性中的潜在作用。温度升高可能通过激活特定阴离子通道促进K⁺外流来增强ABA信号和保卫细胞响应性。此外，活性氧（ROS）放大ABA信号，从而可能在胁迫条件下促进快速气孔关闭。特别有趣的是，气孔大小的微小变化似乎不能解释观察到的气孔导度动态差异，这与先前质疑气孔解剖结构与波动光照下响应速度关系的工作一致。McAusland等（2016）和Brench等（2025）提出其他机制可能贡献于气孔导度动态，包括膜通透性差异、信号组分（如光otropins、隐花色素）和保卫细胞细胞壁特性。近期工作证明气孔大小与速度的关系是物种和叶面依赖的，上表面气孔已知显示快速响应。此处，高温意外诱导上表面气孔宽度降低，表明温度驱动的气孔形态可塑性。这一观察与积累的证据一致，即叶面间气孔调节存在差异，上表面气孔机制对温度特别敏感。为解释观察到的基因型间差异，研究人员提出气孔功能的变异是气孔导度动态对比响应的基础。基因型特异性的叶面组成和代谢调节差异，特别是跨膜运输过程如涉及水通道蛋白、质膜H⁺-ATPases和K⁺通道的过程，可能是气孔动态的贡献因素。淀粉降解已成为气孔开放的关键驱动因素。近期证据表明过氧化氢（H₂O₂）积累可能与淀粉降解协同调节光诱导气孔开放。鉴于活性氧代谢的温度敏感性，高温可能调节淀粉–H₂O₂信号通路，从而影响复合热干旱胁迫下气孔开放速度。进一步整合下表面和上表面气孔响应与保卫细胞代谢的工作可为温度与淀粉降解之间的关系提供新见解。应特别关注参与光诱导气孔开放的途径（如淀粉降解和活性氧信号），以准确预测日益频繁的热干旱事件下气孔导度动态的整株后果。研究结果揭示了气孔导度动态在快速关闭以限制水分损失和快速开放以维持叶片蒸发冷却之间的基本权衡，特别是在复合胁迫下。未发现与整株尺度参数如TE的相关性。为获得此类相关性，需要在更长时间高温暴露下进行类似分析。结论部分翻译：研究人员证明两种基因型均表现出对高温的双相响应，无论是否施加水分亏缺，其特征为初始显著气孔关闭后重新开放。研究人员还证明复合胁迫条件下两种基因型的气孔开放速度均大幅增加。然而，基因型在气孔关闭动态上存在差异，I214表现出明显快于Carpaccio的响应。研究人员提出气孔导度动态可能有助于环境相关胁迫组合下水分保持与叶片热调节之间的权衡。这些发现应在更广泛的基因型范围内验证，以进一步探究气孔导度动态、蒸腾效率和生产力之间的潜在联系。此外，田间条件在环境变异性、树龄以及胁迫事件的持续时间和严重程度方面与受控实验条件存在显著差异。因此，田间验证对于评估研究发现对具有增强生产力和复合胁迫耐受性的基因型育种和筛选的适用性至关重要。