酵母提取物与丁酸钠叶面诱导重塑鼠尾草（Salvia officinalis）萜类代谢

《Plant Physiology and Biochemistry》：Comparative Foliar Elicitation with Yeast Extract and Sodium Butyrate Reshapes Terpenoid Metabolism in Salvia officinalis

　　

鼠尾草（Salvia officinalis L.）是广泛栽培的药用和芳香作物，因其萜类、酚酸和黄酮类等生物活性物质的多样性而具有重要工业价值。为应对栽培植物次生代谢物积累的可塑性所导致的植物化学不一致性对工业标准化的制约，研究人员采用非转基因的叶面诱导策略，比较了经典生物诱导子酵母提取物（YE）与双作用代谢调节剂丁酸钠（NaB）对鼠尾草萜类代谢的重编程效应。研究整合了GC–MS代谢物谱分析、定量基因表达分析、抗氧化与抗增殖活性测定、分子对接以及ADMET预测。结果表明，YE作为广谱诱导子，同步上调甲羟戊酸（MVA）和甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径相关基因，其中SoFPPS2诱导最强（4.08倍），并中等程度富集β-石竹烯、绿花醇和铁锈醇，同时基本保持单萜主导的化学型。NaB则表现出高度不对称的转录响应，SoHUMS转录本丰度在25 mM和50 mM处理下分别诱导15.81倍和13.71倍，β-石竹烯相对峰面积从对照的3.00%增至31.95%和29.70%，铁锈醇最高增加3.5倍，并检测到α-葎草烯、石竹烯氧化物、α-古芸烯及推定14β-孕烷等仅在NaB处理下出现的化合物。NaB处理提取物对MCF-7细胞的抗增殖活性显著增强，IC50从对照的366.87 μg mL-1降至91.0 μg mL-1。分子对接显示铁锈醇对COX-2、CDK6、MCL-1、ERα和PR等多个乳腺癌相关靶点具有最强结合亲和力（-8.1至-10.5 kcal mol-1），β-石竹烯和石竹烯氧化物等也显示有利结合。ADMET分析表明铁锈醇和β-石竹烯具有良好生物利用度评分（0.55）。研究结果为叶面诱导作为非转基因策略调控药用芳香植物代谢谱提供了依据，但碳分配变化及所提出的表观遗传调控机制尚待验证。

【研究背景】鼠尾草（Salvia officinalis L.）是重要的药用和芳香作物，其商业价值与富含萜类的代谢谱密切相关。松香烷型二萜（如鼠尾草酸、鼠尾草酚及其前体铁锈醇）和倍半萜β-石竹烯是关键的药效团，具有抗氧化、抗炎和抗增殖活性。鼠尾草中萜类的生物合成由两个空间分离但代谢互联的途径编排：胞质甲羟戊酸（MVA）途径供应法尼基焦磷酸（FPP）用于倍半萜和三萜合成；质体甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径提供香叶基焦磷酸（GPP）用于单萜合成，并提供香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）用于二萜（包括松香烷型二萜）合成。五环三萜酸（白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸）亦为重要生物活性成分，与倍半萜和二萜共享异戊二烯C5前体，鲨烯合酶催化三萜生物合成的首个 committed 步骤。然而，田间栽培鼠尾草的次生代谢物积累受遗传、个体发育、形态发生和环境因素复杂互作影响，气候波动、季节变化、土壤质量和生物胁迫可显著改变代谢谱，导致产品质量不稳定，制约工业标准化。遗传工程和基因组编辑虽具潜力，但面临严格监管、公众接受度有限及多基因代谢瓶颈等障碍。因此，建立非转基因、可持续且易于规模化的农艺策略（如诱导）具有战略意义。诱导是外源施加生物或非生物刺激以激活植物防御和胁迫信号网络的方法。酵母提取物（YE）作为病原相关分子模式，触发茉莉酸（JA）介导的信号级联，可同步上调MVA和MEP途径基因。化学表观遗传诱导则利用染色质结构小分子调节剂解锁转录抑制的次生代谢基因簇。丁酸钠（NaB）是短链脂肪酸和组蛋白脱乙酰化酶（HDAC）抑制剂，在植物中可诱导组蛋白超乙酰化，松弛染色质结构，促进RNA聚合酶II接近先前沉默的启动子。此外，外源丁酸可能进入植物组织并经β-氧化生成乙酰辅酶A，而乙酰辅酶A是MVA途径的主要底物，故NaB可能具有双重作用机制：作为代谢"燃料"增加前体可用性，同时作为表观遗传"去阻遏物"通过染色质重塑发挥作用。然而，NaB作为叶面诱导子在药用植物中的应用尚属空白，且经典生物诱导子（YE）与双作用代谢调节剂（NaB）在芳香作物中对MVA和MEP途径碳流差异分配能力的直接比较研究有限。本研究旨在探究YE和NaB叶面施用是否差异性重编程鼠尾草萜类代谢，通过整合GC–MS代谢物谱分析、定量基因表达分析、抗氧化与抗增殖测定、分子对接和ADMET预测，比较两种诱导策略的调控和功能后果，并评估NaB介导的化学表观遗传诱导是否提供一种实用的非转基因策略以富集高价值萜类并增强提取物生物活性。

【研究方法】研究人员以Shiraz大学农学院研究温室（伊朗法尔斯省）的均匀鼠尾草幼苗为材料，在受控温室条件下栽培于5 L塑料盆（含灭菌壤土:砂:泥炭2:1:1混合基质），自然光周期约12–14 h，日/夜温度25–30 °C/15–20 °C，相对湿度50–65%，每3–4天灌溉，每周施用平衡营养液，不施合成农药。植株建立六周后于营养期（6–8片完全展开叶）喷雾处理。设四个叶面处理：对照（蒸馏水）、YE（2 g L-1）、NaB（25 mM）、NaB（50 mM）。YE浓度依据Salvia mirzayanii先前优化研究选择，NaB浓度依据其诱导植物组蛋白超乙酰化和代谢重编程的报道选择，较高叶面浓度旨在补偿喷雾后有限的角质层渗透和吸收。处理每5天重复一次，共四次。末次处理后5天采收叶片，40 °C阴干至恒重，粉碎过40目筛，?20 °C保存。以80%甲醇（1:10, w/v）超声辅助提取（20 kHz，50%振幅，100%输出功率，50%脉冲循环，10 min），离心后残渣重复提取两次，合并上清过滤并减压浓缩，用于生物活性测定。主要关键技术方法包括：（1）定量实时PCR（qRT-PCR）检测六个萜类生物合成基因（SoFPPS2、SoGGPPS、SoGPS、SoHUMS、SoSQUS、SoTPS6）转录本丰度，以肌动蛋白为参考基因，采用2^?ΔΔCt法计算相对表达；（2）气相色谱–质谱联用（GC–MS）进行甲氧基叶提取物的定性和半定量 profiling，HP-5MS毛细管柱，电子轰击电离（70 eV），全扫描m/z 40–550，经NIST 2011谱库 tentative 鉴定，以峰面积归一化表示相对丰度；（3）DPPH自由基清除法评价抗氧化活性，计算IC50；（4）MTT法评价提取物对MCF-7人乳腺癌细胞系的抗增殖活性，计算IC50；（5）分子对接（PyRx）针对六个乳腺癌相关蛋白靶点（COX-2、CDK6、BCL-2、MCL-1、ERα、PR），以共晶参考抑制剂验证方案（RMSD < 2.0 ?）；（6）SwissADME预测ADMET性质和类药性。样本队列来源为Shiraz大学农学院研究温室栽培的鼠尾草幼苗；MCF-7细胞系购自伊朗国家细胞库（Pasteur研究所，德黑兰）。

【研究结果】
3.1 萜类生物合成基因的转录响应：通过qRT-PCR量化六个代表MVA和MEP途径不同代谢节点的基因转录本水平，发现YE和NaB引起显著不同的转录响应。YE作为广谱诱导子，显著上调MVA和MEP途径相关基因，最强诱导为SoFPPS2（4.08倍），其次SoTPS6（3.71倍）和SoHUMS（3.22倍），MEP相关基因SoGGPPS（1.97倍）和SoGPS（1.22倍）中度增加。NaB则产生高度不对称转录谱，优先诱导倍半萜合酶基因SoHUMS，25 mM和50 mM处理分别增加15.81倍和13.71倍（均P < 0.001）；SoTPS6表达亦显著升高（4.25倍和5.27倍）；上游前体供应基因响应相对温和，SoFPPS2仅在25 mM显著增加（2.38倍），SoGPS仅在50 mM增加（1.92倍），SoGGPPS呈剂量依赖响应，50 mM达3.23倍。SoHUMS超强诱导与上游前体生物合成相对温和激活之间的显著不平衡提示形成实质性代谢汇，引导胞质FPP流向倍半萜生物合成。SoSQUS在50 mM NaB下增加2.14倍（P < 0.05），YE对其无显著影响。
3.2 GC–MS代谢物谱分析：通过GC–MS分析挥发性及半挥发性萜类，发现转录变化伴随代谢物组成的显著改变。未处理对照呈现典型的单萜主导化学型，β-侧柏酮（25.96%）、樟脑（19.95%）和1,8-桉叶素（13.37%）为主要成分，β-石竹烯（3.00%）、铁锈醇（1.30%）和油酸（10.59%）水平较低。YE处理基本保持原生化学型谱，主要单萜基本不变（β-侧柏酮27.27%，樟脑19.87%），而MVA衍生代谢物显著增加：β-石竹烯增加4.28倍（12.85%），绿花醇增加3.79倍（12.95%），铁锈醇增加2.92倍（3.78%）。NaB处理则产生更显著的萜类谱变化，最突出的是β-石竹烯相对富集，归一化峰面积从对照3.00%增至25 mM的31.95%和50 mM的29.70%，约十倍增加，成为测定谱中的主导成分，与SoHUMS强诱导一致。铁锈醇积累呈不同调控模式：25 mM NaB下SoFPPS2相关表达最高但SoGGPPS相关表达较弱，铁锈醇积累较低；50 mM NaB下SoGGPPS强诱导与较高铁锈醇积累平行，支持增强的质体MEP途径通量作为二萜生物合成主要驱动。仅在NaB处理下检测到的化合物包括α-葎草烯（25 mM 0.55%，50 mM 0.32%）、石竹烯氧化物（0.94%和0.63%）、α-古芸烯（1.34%和1.83%）及推定14β-孕烷（1.11%和2.86%）。酚类化合物表现差异响应：4-乙烯基愈创木酚从对照2.66%降至YE 0.90%并在NaB下不可检测；焦性没食子酸从2.35%降至YE 0.80%并在NaB下缺失。主要单萜下降：1,8-桉叶素从13.37%降至25 mM的6.71%和50 mM的5.54%；β-侧柏酮从25.96%降至14.45%和13.45%。樟脑在各处理间保持约20%的相对稳定贡献。三种主要单萜合计相对丰度从对照59.28%降至50 mM NaB的39.20%，而选定化合物（β-石竹烯、绿花醇、铁锈醇、推定14β-孕烷和油酸）合计从18.31%增至50.43%。
3.3 抗氧化活性（DPPH法）：通过DPPH自由基清除法评价，发现抗氧化能力呈处理依赖性下降，与酚类代谢物耗竭平行。未处理对照IC50为77.18 ± 0.34 μg mL-1，25 mM NaB处理后基本不变（77.71 ± 0.20 μg mL-1）；YE处理后中度降低（82.68 ± 0.35 μg mL-1），50 mM NaB进一步下降（89.00 ± 2.62 μg mL-1），IC50约增加14%。抗坏血酸在相同条件下IC50为13.32 μg mL-1。抗氧化能力下降与代谢组数据一致：4-乙烯基愈创木酚和焦性没食子酸（强酚类抗氧化剂）在诱导后显著降低并在NaB处理下不可检测。酚类化合物（特别是迷迭香酸及相关苯丙素类）是鼠尾草主要抗氧化成分，该代谢物类别的耗竭为DPPH清除活性下降提供了合理解释，提示苯丙素与萜类生物合成之间的代谢权衡。
3.4 抗增殖活性（MTT法）：通过MTT法评价提取物对MCF-7人乳腺癌细胞的抗增殖活性，发现诱导处理后显著增强。未处理植物甲氧基提取物IC50为366.87 ± 7.10 μg mL-1，YE处理降至117.7 ± 2.04 μg mL-1；NaB处理改善更显著，25 mM和50 mM分别为105.1 ± 3.59 μg mL-1和91.0 ± 2.86 μg mL-1，最高NaB浓度相对对照提取物抗增殖效力约提高75%。50 mM NaB提取物的优越活性不能仅由β-石竹烯丰度解释（其相对水平略低于25 mM NaB的31.95% vs 29.70%），更可能归因于高剂量诱导后积累的多种生物活性成分的联合作用，符合植物化学多药理学概念。支持该解释的代谢物变化包括：50 mM NaB下绿花醇（6.88%增至8.51%）、α-古芸烯（1.34%增至1.83%）和14β-孕烷（1.11%增至2.86%）丰度进一步增加，且石竹烯氧化物仅在NaB处理下检测到。
3.5 分子对接：为探究诱导提取物增强抗增殖活性的分子基础，将GC–MS鉴定的所有主要代谢物对六个乳腺癌相关靶点（COX-2、CDK6、BCL-2、MCL-1、ERα、PR）进行分子对接。铁锈醇在多个靶点中产生最有利对接分数，包括COX-2（-10.5 kcal mol-1）、CDK6（-9.5 kcal mol-1）、MCL-1（-8.4 kcal mol-1）、ERα（-9.2 kcal mol-1）和PR（-9.3 kcal mol-1）。NaB处理下富集的β-石竹烯和石竹烯氧化物等也对选定靶点显示有利对接分数。共晶参考抑制剂再对接RMSD均低于2.0 ?，验证了方案可靠性。铁锈醇在所有六个靶点中一致排名最高亲和力植物化学物，预测结合能范围-8.1至-10.5 kcal mol-1，其广泛互作谱支持其作为多靶点生物活性化合物的潜力。NaB富集的多种萜类（β-石竹烯、石竹烯氧化物、绿花醇、α-葎草烯、α-古芸烯）也对多个受体显示有利互作，提示NaB提取物增强的抗增殖活性可能源于多种互补代谢物的集体作用而非单一铁锈醇。
3.5.1 ADMET分析：通过SwissADME评价鉴定植物化学物的药代动力学和类药性，发现多种主要萜类显示有利的理化性质和药代动力学谱。十一种化合物预测具有高胃肠道吸收，包括铁锈醇、绿花醇、石竹烯氧化物、油酸、龙脑、乙酸龙脑酯、樟脑、异龙脑、大马酮、β-侧柏酮和1,8-桉叶素；十二种化合物预测可穿过血脑屏障。所有测试化合物符合Lipinski五规则，九种额外满足Ghose、Veber、Egan和Muegge类药性过滤器。铁锈醇和β-石竹烯生物利用度评分为0.55，而参考药物venetoclax和S63845为0.17。除新别罗勒烯外所有化合物Log Kp均为负值，提示预测皮肤渗透性较低。多数化合物水溶性中至高度，14β-孕烷预测溶解性差。Log P范围从β-侧柏酮2.35至14β-孕烷6.29。
3.6 工业作物增值的实际考量：YE基本保持单萜丰富谱，同时产生选定倍半萜和二萜的中度相对富集，可能适用于风味、香料、化妆品和营养保健品应用。NaB产生更显著的组成变化，铁锈醇相对富集高达3.5倍，β-石竹烯约十倍于对照，与提取物对MCF-7细胞增强的抗增殖活性一致。两种方法均涉及无遗传修饰的外源处理，叶面施用为温室和田间栽培提供了潜在可转移的处理形式，但实际可扩展性未评估。商业开发需评估处理成本、施用频率、生物量生产力、化合物回收、诱导子残留及合规性。方法学局限性包括：NaB的HDAC介导效应仍为假设（未测组蛋白乙酰化和HDAC活性）；IPP、DMAPP和FPP未量化；三萜和植物甾醇未用当前GC–MS工作流量化；代谢物谱为相对峰面积百分比而非绝对浓度；仅评价两个NaB浓度；实验在受控温室条件下进行。

【讨论与结论】讨论部分指出，YE响应与酵母成分作为PAMPs被识别及茉莉酸响应防御信号的可能参与一致，但本研究未量化JA及其衍生物，茉莉酸参与仍为基于文献的假设而非在鼠尾草中证实的机制。SoFPPS2转录丰度增加本身不能证明FPP可用性增加或优先分配至倍半萜生物合成，转录丰度、蛋白丰度和酶活性之间的差异、上游前体形成调控、异戊二烯途径间反馈互作及FPP在竞争下游反应间的分配等调控过程可解释转录与代谢通量之间的非比例关系。NaB对SoHUMS的优先诱导提示基因特异性表观遗传调控的可能性，作为HDAC抑制剂，NaB可促进组蛋白超乙酰化并改变转录可及性，但启动子结构、染色质可及性和转录因子可用性的差异可贡献于不同响应；组蛋白乙酰化和HDAC活性未测定，染色质调控是否贡献于该选择性仍未解决。丁酸的代谢贡献是另一种可能性，其代谢可能潜在地贡献于乙酰辅酶A可用性从而影响MVA途径前体供应，但该解释需要外源丁酸被同化并贡献于鼠尾草相关乙酰辅酶A库的证据，表观遗传调控和改变的前体供应仍为NaB响应的可能非排他性解释而非已证实的双重机制。GC–MS分析聚焦于挥发性和半挥发性萜类，未量化五环三萜酸（白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸）或植物甾醇（谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇），故SoSQUS诱导的代谢后果无法确定。代谢物谱与MVA和MEP途径的转录特征密切 mirror，表明诱导基因表达转化为可测量的萜类积累变化。NaB处理下仅在处理组出现的化合物提示激活了原本沉默或低丰度的生物合成路线，HDAC介导的弱表达生物合成路线去阻遏提供一种可能解释，但化合物生物合成起源和表观遗传机制均未在本研究中确立，该解释仍为推测性。抗氧化能力下降与酚类代谢物耗竭一致，提示苯丙素与萜类生物合成之间的代谢权衡。NaB提取物优越的抗增殖活性更可能归因于多种生物活性成分的联合作用而非单一化合物，符合植物化学多药理学概念。分子对接结果为NaB处理提取物增强的生物活性提供了连贯的分子理论基础，但对接仅预测潜在结合互作，不能证明直接靶点结合或药理功效，应视为假设生成性结果。总之，研究结果表明鼠尾草叶面诱导产生不同的转录和组成响应：YE在测定基因中引发更广泛响应，同时基本保持单萜丰富谱；NaB引发更选择性响应，特征为SoHUMS强诱导、β-石竹烯和铁锈醇相对富集及额外化合物（包括推定14β-孕烷）的检测。这些发现激发进一步评价叶面诱导作为非转基因方法调控药用和芳香植物谱，而碳分配变化和所提出的调控机制尚待确立。研究结论部分译为：本研究证明，叶面施用酵母提取物和丁酸钠差异性重编程鼠尾草萜类代谢。YE作为广谱生物诱导子，同步激活MVA和MEP途径基因并中等富集β-石竹烯、绿花醇和铁锈醇，基本保持原生单萜主导化学型；NaB则通过优先超诱导SoHUMS（>15倍）产生高度不对称转录响应，导致β-石竹烯相对峰面积约十倍增加、铁锈醇高达3.5倍富集，并检测到α-葎草烯、石竹烯氧化物、α-古芸烯及推定14β-孕烷等NaB特异性化合物。NaB处理提取物对MCF-7细胞抗增殖活性显著增强（IC50从366.87降至91.0 μg mL-1），分子对接揭示铁锈醇对多个乳腺癌相关靶点具有最强预测结合亲和力，ADMET分析表明铁锈醇和β-石竹烯具有有利类药性。这些结果为叶面诱导作为非转基因、可扩展策略调控药用芳香植物次生代谢谱提供了实验依据，但碳分配重定向和NaB表观遗传机制尚需通过绝对代谢物定量、同位素示踪通量分析及组蛋白乙酰化测定加以验证。