《Plant Physiology and Biochemistry》：Genome-wide analysis of the
TAF gene family reveals a role for
GhTAF8 in cottonseed oil accumulation
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TATA-box结合蛋白相关因子（TAFs）与TATA-box结合蛋白（TBP）结合形成转录因子IID（TFIID），这是启动和控制基因转录所需的核心转录复合体。TAFs通过多种机制参与转录调控，如促进启动子识别、将转录激活因子的调控信号传递给基础转录机器、协
TATA-box结合蛋白相关因子（TAFs）与TATA-box结合蛋白（TBP）结合形成转录因子IID（TFIID），这是启动和控制基因转录所需的核心转录复合体。TAFs通过多种机制参与转录调控，如促进启动子识别、将转录激活因子的调控信号传递给基础转录机器、协调TFIID与核小体之间的相互作用、不依赖激活因子促进转录再起始以及与表观遗传调控相关因子结合。在人类、果蝇和酵母中的比较研究已证明TAFs在真核生物中高度保守。越来越多的证据也突出了TAFs在植物生长、发育和胁迫响应中的重要作用，尤其是在模式植物拟南芥中。Bertrand等（2005）表明AtTAF1作为转录共激活因子整合光信号并促进组蛋白乙酰化，从而激活光响应基因转录。AtTAF5（At5g25150）对植物生命周期的完成至关重要，并参与雄配子发生、花序分生组织发育和花粉管生长。AtTAF6（At1g04950）也参与花粉管生长的调控。AtTAF10（At4g31720）的过表达增强拟南芥的耐盐性，而将Flaveria trinervia FtTAF10异位表达于拟南芥则导致部分花不确定性和叶片变形。AtTAF12b（At1g17440）参与未折叠蛋白反应（UPR）并调控根系生长和发育。AtTAF13（At1g02680）与Polycomb抑制复合体2（PRC2）协同介导种子发育过程中的转录调控。在水稻中，OsTAF2通过调节细胞分裂调控粒型。总之，这些发现表明植物TAFs具有多样的调控功能。然而，TAF基因家族尚未在棉花（Gossypium spp.）中被系统鉴定。棉花是重要的经济作物，提供纺织纤维和食用油。它也是研究多倍化和基因组进化的重要模式系统，因而对遗传和进化研究具有很高价值。先前研究证据表明，所有二倍体棉种可能起源于一个共同祖先，随后分化为八个基因组组（A-G）和K3基因组。大约一到两百万年前，非洲A基因组祖先与美洲D基因组祖先之间的杂交产生了四倍体棉花。四个棉种——包括二倍体G. arboreum和G. raimondii，以及四倍体G. hirsutum和G. barbadense——高质量基因组序列的获得促进了基因功能和进化的全基因组研究。尽管TAFs在转录调控和植物发育中已被广泛研究，但其在脂质代谢中的潜在作用仍知之甚少。来自黑腹果蝇的证据表明，单个TAFs可通过调节过氧化物酶体β-氧化相关基因的表达影响脂肪酸组成。种子油积累是一个复杂的生物学过程，需要脂肪酸生物合成、三酰甘油组装和油体形成等多个基因的协同表达。鉴于TAFs作为转录共调控因子的功能，研究人员假设TAFs可能参与棉籽油积累的协同转录调控。然而，棉花TAF家族成员是否参与种子油积累在很大程度上尚未被探索。在本研究中，研究人员在四个棉种中鉴定了124个TAF基因，包括两个二倍体种（G. arboreum和G. raimondii）和两个四倍体种（G. hirsutum和G. barbadense）。研究人员系统分析了其理化性质、系统发育关系、染色体分布、共线性、基因结构、保守基序和结构域组织。随后通过表达谱分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA）研究了GhTAF基因家族在棉籽发育和油积累中的潜在参与。GhTAF8被优先选为与油积累相关的候选基因，并通过拟南芥过表达实验和棉花病毒诱导基因沉默实验进一步评估其功能参与。据研究人员所知，本研究是棉花TAF基因家族的首次系统鉴定，并提供了支持棉花TAF基因参与种子油积累的初步功能证据。这些发现为进一步研究棉花TAFs的功能和调控机制奠定了基础。
**研究背景与问题**：TATA-box结合蛋白相关因子（TAFs）与TATA-box结合蛋白（TBP）结合形成转录因子IID（TFIID），是启动和调控基因转录的核心复合体。TAFs在真核生物中高度保守，在拟南芥中已被证明参与光信号转导、花粉管生长、种子发育和胁迫响应等多种过程。然而，TAF基因家族在棉花中尚未被系统鉴定，其是否参与棉籽油积累也不清楚。棉花既是重要的纤维作物也是重要的油料作物，解析棉籽油积累的调控机制对品质改良具有重要意义。已有证据表明果蝇TAFs可影响脂肪酸组成，但植物TAFs与脂质代谢的关系研究极为有限。因此，研究人员假设棉花TAFs可能参与棉籽油积累的转录调控，并开展了全基因组鉴定与功能验证。
**研究内容与结论**：研究人员在四个棉种中系统鉴定了124个TAF基因，通过系统发育、染色体定位、共线性、基因结构、保守基序和结构域分析揭示了该家族的进化保守性与分化特征。结合转录组分析和WGCNA，鉴定出GhTAF8为与棉籽油积累相关的候选基因。功能验证表明，GhTAF8在拟南芥中过表达可增加种子油含量和种子面积，在棉花中沉默GhTAF8则降低棉籽油含量、种子面积和百粒重。研究首次系统鉴定了棉花TAF基因家族，并提供了GhTAF8参与种子油积累的初步功能证据，为棉花品质改良提供了候选基因资源。
**关键技术方法**：研究人员利用生物信息学方法（BLASTp序列比对、CDD和SMART结构域验证、MEGA邻接法建树、MCScanX共线性分析、MEME基序鉴定）系统鉴定了四个棉种的TAF基因家族；利用RNA-seq对两个含油量差异显著的棉花品系（T111高油和T113低油）在5个胚珠发育时期（10、15、20、25和30 DPA）进行转录组分析；采用WGCNA构建共表达网络；通过亚细胞定位、拟南芥遗传转化过表达、病毒诱导基因沉默（VIGS）进行功能验证；利用GC-FID（气相色谱-火焰离子化检测器）和核磁共振（NMR）分析仪测定油脂含量与脂肪酸组成。
**研究结果**：
**3.1 棉花TAF基因家族的鉴定与系统发育分析**：以拟南芥TAF蛋白序列为查询，在四个棉种中分别鉴定到22（G. arboreum）、19（G. raimondii）、39（G. hirsutum）和44（G. barbadense）个TAF基因，四倍体棉种中TAF基因数目约为二倍体的两倍，暗示该家族在棉花基因组进化中高度保守。蛋白长度（77–1897 aa）、分子量（9.00–214.20 kDa）和等电点（4.38–10.21）变异较大。系统发育分析将124个棉花TAFs与18个AtTAFs分为6个亚家族（I–VI），各亚家族成员数分别为32、21、8、17、26和38，其中TAF8同源基因数目最多，TAF2最少。
**3.2 染色体定位、共线性与选择压力分析**：TAF基因在四个棉种染色体上呈不均匀分布。种间共线性分析鉴定到Ga-Gh、Ga-Gb、Gr-Gh和Gr-Gb比较中分别有25、26、25和21对重复基因对；种内共线性分析在G. hirsutum和G. barbadense中各鉴定到31对共线TAF基因对，多数TAF基因在A或D亚基因组内表现出强共线性，表明多倍化后高度保守。Ka/Ks分析显示所有同源基因对的Ka/Ks值均小于1，其中48对小于0.5，表明该家族主要经历了纯化选择。
**3.3 棉花TAF基因家族的结构与保守基序分析**：在39个GhTAF蛋白中鉴定到20个保守基序，多数成员含有motif 6，但不同亚家族间基序分布模式存在差异。结构域分析与保守基序模式基本一致。基因结构分析显示外显子-内含子组织变异较大，少数基因仅含单个外显子。这些结构特征与系统发育聚类基本一致，提示亚家族内功能保守而亚家族间可能存在功能分化。
**3.4 陆地棉胚珠中GhTAFs的表达谱分析与WGCNA**：利用高油品系T111和低油品系T113在5个胚珠发育时期的转录组数据，将GhTAF基因分为5个表达簇。Cluster I和IV表达极低，Cluster II、III和V表达较高。近半数GhTAF基因表现出阶段特异性表达模式。WGCNA分析显示多个模块与特定发育阶段强相关，其中蓝色模块与20 DPA（快速油积累关键期）的相关系数r = 0.69。蓝色模块中GhTAF8（Ghir_D11G035840）的模块隶属度kMEblue = 0.96，模块内连通性kWithin = 971.68，在9个GhTAF基因中排名第一。qRT-PCR证实GhTAF8在20 DPA时高油品系T111中的表达显著高于低油品系T113。以Ghir_D11G035840为中心的共表达网络鉴定到133个强相关基因（Pearson's r ≥ 0.95），包括VRN1和MYB3R4等与种子发育和细胞周期调控相关的转录因子。
**3.5 GhTAF8在拟南芥中正向调控油含量**：亚细胞定位显示GhTAF8定位于细胞核。通过农杆菌介导转化获得8个独立的GhTAF8过表达拟南芥株系，Western blot证实GFP标签融合蛋白（约70 kDa）在兩個独立株系中表达。表型分析表明过表达株系的种子面积显著大于野生型，GC-FID分析显示过表达株系种子油含量显著增加，C18:1（油酸）和C18:2（亚油酸）含量显著升高。
**3.6 GhTAF8病毒诱导沉默显著降低棉籽油含量**：VIGS实验以PDS为阳性对照，沉默植株表现出典型黄化表型。RT-qPCR证实CLCrV::GhTAF8植株中GhTAF8转录水平显著降低。表型分析显示沉默GhTAF8导致棉籽油含量、种子面积和百粒重均显著下降。
**讨论与结论**：研究人员系统鉴定了四个棉种中的124个TAF基因，四倍体中的基因数目约为二倍体的两倍，与全基因组复制一致。系统发育将TAF蛋白分为6个亚家族，成员分布不均，提示进化保守性与功能分化并存。值得注意的是，AtTAF14和AtTAF15缺乏整合入TFIID的生化证据，不被视为真正的TAFs；At5g15570虽在TAIR中注释为TAF3，但缺乏后生动物TAF3典型的组蛋白折叠结构域（HFD），且在其他植物（水稻、绿豆）中缺乏明确的TAF3直系同源基因，提示功能性TAF3在植物中不保守。基因复制分析表明TAF基因不均匀分布于染色体，共线性和Ka/Ks分析显示多数重复基因经历了强纯化选择（Ka/Ks < 1）。外显子-内含子结构的显著变异提示不同成员经历了不同的进化轨迹。转录组分析揭示许多GhTAF基因在胚珠发育中呈阶段特异性或高表达模式，WGCNA鉴定到蓝色模块与20 DPA（快速油积累关键期）强相关，GhTAF8在蓝色模块中连通性最高，且在20 DPA时高油品系中表达显著高于低油品系。GhTAF8在拟南芥中过表达增加种子油含量，在棉花中沉默降低种子油含量，增益和缺失功能表型方向一致，提供了互补证据支持GhTAF8参与种子油积累。然而，由于拟南芥和棉花在种子发育和脂质代谢方面存在差异，拟南芥表型需谨慎解读，VIGS的非特异性生理效应也不能完全排除，仍需在棉花中建立稳定的敲除和过表达株系以确定GhTAF8精确的物种特异性功能。共表达网络显示GhTAF8与VRN1和MYB3R4等转录调控因子共表达，但共表达本身不能建立直接调控关系，GhTAF8的下游调控机制仍有待阐明。研究结论为：对四个棉种的综合分析鉴定了124个TAF家族成员，系统发育关系支持其分为6个亚家族；表达谱分析揭示了部分GhTAF基因在棉籽发育中呈阶段特异性或持续高表达；通过WGCNA鉴定GhTAF8为与脂质积累和胚珠发育相关的候选调控因子；功能实验表明GhTAF8过表达与拟南芥种子油含量增加相关，而VIGS介导的棉花中GhTAF8沉默与棉籽油含量降低相关；这些互补结果支持GhTAF8参与种子油积累。总体而言，本研究拓展了对GhTAF进化和功能的理解，并突出了该基因家族对棉籽油积累的潜在贡献。
