《Plant Physiology and Biochemistry》：Identification and functional characterization of pineapple
AcGPX5 in oxidative stress response
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染色体末端纯合性区域（runs of homozygosity, ROH）在菠萝驯化过程中具有重要作用，定位于这些区域中的基因主要富集于氧化还原酶（oxidoreductase）活性相关功能。研究人员从末端ROH中鉴定并功能表征了AcGPX5（谷胱甘肽过氧
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染色体末端纯合性区域（runs of homozygosity, ROH）在菠萝驯化过程中具有重要作用，定位于这些区域中的基因主要富集于氧化还原酶（oxidoreductase）活性相关功能。研究人员从末端ROH中鉴定并功能表征了AcGPX5（谷胱甘肽过氧化物酶家族成员），其在调控氧化还原胁迫响应中发挥关键作用。菠萝（Ananas comosus）为重要热带果树，果实成熟伴随活性氧（reactive oxygen species, ROS）大量产生，采后过量ROS积累导致衰老与品质劣变。已有基因组重测序显示，无性繁殖驱动的有丝分裂重组可在染色体末端形成ROH；转录组分析表明，ROH区域内基因在果实发育中参与次生代谢、器官衰老及氧化胁迫响应。研究人员通过整合多阶段果实转录组，将ROH基因划分为五类表达簇，并基于氧化胁迫相关GO（Gene Ontology）条目筛选出唯一位于ROH内的GPX家族成员AcGPX5。蛋白纯化与酶活检测证实，AcGPX5不具备GSH（glutathione）或NADPH依赖活性，而表现出硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）依赖的谷胱甘肽过氧化物酶活性，对H2O2催化效率高于t-BuOOH与Cum-OOH。胁迫处理与转基因功能验证显示，AcGPX5受ABA（abscisic acid）、H2O2、低温、高温及盐胁迫诱导，其过表达可上调CAT（catalase）、APX（ascorbate peroxidase）、Trx与MDHAR（monodehydroascorbate reductase）等抗氧化基因，增强氧化耐受性；在番茄果实中异源过表达延迟成熟，在拟南芥atgpx6与atgpx8突变体中可部分回补根系与发育表型。该研究揭示ROH区域基因在菠萝果实氧化还原调控中的功能，并为采后抗逆育种提供靶点。
论文主体解读
研究背景与问题提出
菠萝为典型无性繁殖热带果树，长期克隆增殖促使体细胞有丝分裂重组累积，在染色体末端形成连续纯合片段，即末端纯合区（runs of homozygosity, ROH）。已有研究证实ROH广泛存在于菠萝基因组，但其中关键基因如何参与果实发育、成熟及氧化胁迫应答仍缺乏功能证据。果实成熟是高度活跃的氧化代谢过程，活性氧（reactive oxygen species, ROS）作为双刃剑，既参与信号调控，又在采后过度积累引发膜脂过氧化、果肉软化和褐变衰老。谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPX）是植物硫醇依赖型过氧化物酶，借助硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）清除H2O2与有机氢过氧化物，维持 redox 稳态。然而菠萝GPX家族在ROH背景下的进化归属、酶学特性与生物学功能尚未系统阐明，亟需从驯化基因组区段中挖掘具有采后改良潜力的候选基因。
研究人员开展的工作与核心结论
研究人员以菠萝为对象，联合重测序变异注释、果实多阶段转录组、系统发育与基因结构分析、原核蛋白表达与酶活测定、亚细胞定位、转基因过表达及异源互补实验，锁定ROH内唯一GPX成员AcGPX5，证明其具有Trx依赖过氧化还原活性，并正向调控ABA介导的氧化防御与果实成熟进程。研究意义在于：首次将染色体末端ROH、GPX氧化还原酶与菠萝采后衰老抗逆性状建立功能联系，为无性繁殖作物“驯化纯合区—抗氧化基因—品质调控”研究提供范式。
主要关键技术方法
研究基于新加坡西班牙组（Ac58s、Ac67s、Ac63s）与无ROH对照品种的重测序数据，利用VariantQC进行变异注释；以‘Bali’菠萝花后20、40、60、70天果肉为样本开展RNA-seq，经比对、定量与层次聚类将ROH基因分为5簇；通过MEGA构建跨27物种GPX系统树，DNAMAN进行序列比对；原核表达AcGPX5并纯化，以Trx/GSH为电子供体测定底物特异性；利用烟草瞬时表达观察GFP融合蛋白定位；通过农杆菌介导转化获得AcGPX5过表达菠萝、拟南芥互补atgpx6/atgpx8突变体，并以番茄果实瞬时过表达验证成熟表型。
研究结果
3.1 菠萝染色体末端纯合区的变异解析
通过对不同品种重测序SNP与InDel注释，研究人员发现新加坡西班牙组品种在染色体末端呈现极低单例SNP与杂合率，确认末端ROH块存在，为后续区域基因筛选提供基因组基础。
3.2 末端ROH基因的功能与表达聚类
对1512个ROH基因经表达过滤后做GO富集，显示其关联ADP结合、氧化还原酶（oxidoreductase）活性、氧化胁迫响应等条目。按果实S1–S4阶段表达模式聚为5簇：簇1在成熟中后期高表达，富集氧化还原与胁迫响应，AcGPX5即属此簇。
3.3 AcGPXs系统发育、结构与亚细胞定位
菠萝GPX家族含5个成员，AcGPX5定位于Chr8，编码239 aa蛋白，与拟南芥AtGPX6同源，含3个保守基序与半胱氨酸残基。烟草瞬时表达显示AcGPX5定位于细胞质、内质网（endoplasmic reticulum, ER）与细胞核，提示其多维 redox 调控潜力。
3.4 重组AcGPX5的酶学性质
纯化处理后可溶性蛋白在Trx体系下还原H2O2、t-BuOOH与Cum-OOH，其中对H2O2活性最高；GSH或NADPH体系未检出活性，明确其为Trx依赖型谷胱甘肽过氧化物酶。
3.5 AcGPX5的生物学功能
胁迫qPCR显示AcGPX5受冷、热、盐、ABA、H2O2、SA诱导，启动子含ABRE元件。过表达菠萝在ABA下CAT、APX、Trx、MDHAR显著上调；番茄异源过表达使转色延迟；拟南芥中AcGPX5回补atgpx6/atgpx8过长根与早薹表型，并在BPA与H2O2下恢复根生长耐受，证明功能保守与氧化保护能力。
讨论与结论翻译
讨论指出，末端ROH是无性繁殖驯化印记，其内基因协调参与ROS清除、茉莉酸合成、糖代谢与细胞器退化。AcGPX5作为ROH内唯一GPX，以Trx为电子供体调控成熟相关氧化还原平衡；其过表达增强抗氧化网络、延缓果实软化转色，与桃、龙眼等GPX报道一致。异源系统验证虽不完全等同菠萝原生调控，但多体系表型一致支持其保守功能。
结论部分翻译：
该研究揭示染色体末端纯合区基因在果实成熟氧化还原调控中的关键作用，尤其证实AcGPX5在胁迫下维持 redox 稳态的功能。功能证据涵盖菠萝、拟南芥与番茄体系，确立AcGPX5为无性繁殖作物抗逆与品质改良的候选靶标，也为解析ROH区域其他驯化基因提供基础。
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