高光强诱导草莓（Fragaria × ananassa）叶际真菌组宿主氧化还原重塑并与Fusarium定向演替相关

《Plant Physiology and Biochemistry》：High light intensity induces host redox remodeling associated with directional Fusarium succession in the strawberry ( Fragaria × ananassa) phyllosphere mycobiome

　　

高光强诱导草莓叶片产生氧化胁迫与宿主氧化还原重塑。该氧化还原转变与Fusarium（FFSC）的定向演替相关。F. fujikuroi通过更优的H₂O₂解毒效率竞争胜过其他菌株。研究人员以栽培草莓（Fragaria × ananassa）'粉玉'为材料，在受控环境植物工厂中设置低光（LL，226.4 μmol·m^?2·s^?1）、中光（ML，452.8 μmol·m^?2·s^?1）和高光（HL，600 μmol·m^?2·s^?1）3个光强处理，各16次重复。研究人员记录了株高、叶柄长、冠径、小叶尺寸、叶片数、花数、匍匐茎数和果数等农艺指标，并使用SPAD-502仪测定相对叶绿素含量。在红熟期采集叶片，采用微板读数仪于450 nm、470 nm和240 nm分别测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性，于415 nm测定H₂O₂含量。研究人员于绿果期和红熟期测定果实可溶性糖和总可滴定酸含量。研究人员提取草莓叶片总微生物基因组DNA，扩增真菌特异性ITS1区域，在Illumina NextSeq 2000平台测序，基于QIIME2（版本2020.2）框架经DADA2降噪为扩增子序列变体（ASVs），对照UNITE数据库（版本8.0）进行物种注释；以加权UniFrac距离计算β多样性，通过主坐标分析（PCoA）可视化群落结构变异，采用PERMANOVA检验（9,999次置换）评估统计显著性。研究人员从健康草莓叶片分离真菌菌株，选取F. fujikuroi和F. equiseti进行体外氧化胁迫与生长试验，在含0、5、10、25和50 mM H₂O₂的PDA平板上于25°C培养并观察菌落生长，在PDB液体培养中于25°C、150 rpm培养并每24 h测定OD₆₀₀至96 h以构建生长曲线，于0、48和96 h测定培养滤液中残余H₂O₂浓度。研究人员开展离体叶片致病性试验，将健康草莓叶片置于1%水琼脂培养基上，针刺微伤口后接种菌丝块，于25°C、80%相对湿度和16 h光照/8 h黑暗光周期下培养5天，根据发病率和可见症状评估致病性。统计分析使用R软件（版本4.5.2），采用phyloseq、vegan和DESeq2包进行生物信息学处理，包括数据标准化、α多样性（Shannon、Simpson）和基于加权UniFrac距离的PCoA；采用PERMANOVA（9,999次置换，P < 0.05）和Tukey's HSD检验（P < 0.05）确定显著差异；多组比较采用单因素方差分析后接Tukey's HSD检验（P < 0.05）；使用pheatmap包生成Pearson相关热图，聚焦真菌类群与抗氧化酶活性之间的关联。折线图数据以平均值±标准误（SE）表示，箱线图数据以中位数和四分位距及最小-最大须线表示，显著性差异设定为P < 0.05。

研究背景：栽培草莓（Fragaria × ananassa）是全球经济价值最高的园艺作物之一。在北温带，草莓主要在秋冬栽培，常遭遇寒潮和光照不足等多变天气，对可持续产量和果实品质构成严重威胁。室内栽培（草莓工厂）在受控环境和产品品质均一性方面优于温室栽培。光强调控是草莓工厂的核心命题，直接影晌植株发育并占据主要能耗成本。低光栽培可降低能耗，但高光栽培因能缩短生长周期而成为室内农业提升产量的有前景策略。然而，高强度光照可能导致植物体内活性氧（ROS）过量积累，即高光胁迫。植物抗氧化系统包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等酶类，在清除ROS和维持细胞氧化还原稳态中起关键作用。因此，在植物工厂生产中，如何优化高光强优势同时减轻高光胁迫的不利影响具有重要研究价值。与对植物生理的影响并行，光强还可调控栖息于叶际环境的微生物群落。研究发现高光强下叶际微生物组成稳定性下降，微生物网络结构更脆弱。真菌通常直接受光源物理性质影响，而细菌间接受到光诱导植物环境变化的影响，且比真菌更保守。一些研究表明光可对真菌施加氧化胁迫，持续光照显著抑制菌丝生长速率；但也有研究表明高光强可触发真菌致病性，促进植物病害发展。在草莓栽培中，叶枯病是最具破坏性的真菌病害之一，前人研究已鉴定其致病菌为Fusarium fujikuroi物种复合群（FFSC）。F. acutatum和F. fujikuroi均为FFSC成员。其他Fusarium种也具致病性；研究表明F. equiseti是导致草莓冠腐病的关键病原菌，毒力高，发病率超过50%。由F. oxysporum f. sp. fragariae（Fof）引起的草莓枯萎病是全球性重要作物病害。综上所述，光强对植物和微生物的独立效应已有报道，但光强如何调控草莓叶际真菌组群落，特别是叶片抗氧化酶活性与真菌演替之间的协同动态，仍存在研究空白。因此，本研究主要关注高光强是否通过调节植物抗氧化系统间接干预叶际真菌组结构组成，从而影响Fusarium等病原菌的潜在定殖风险。研究人员假设高光下抗氧化系统的"生理重塑"与真菌群落的"生态重塑"是相互关联的过程，这些平行转变可能使草莓叶际易感病原菌感染风险增加，并可能由Fusarium等耐胁迫类群的扩张所促进。研究目的：探究光强对草莓叶际真菌组群落的调控及其与叶片抗氧化酶活性和真菌演替的协同动态，为植物工厂优化光照策略提供理论依据。主要结论：高光强诱导草莓叶片产生氧化胁迫，表现为CAT和POD活性显著上调、SOD活性下降、H₂O₂持续积累；该氧化还原转变与叶际真菌群落中FFSC的定向富集相关；F. fujikuroi通过更优的H₂O₂解毒效率在高浓度H₂O₂胁迫下竞争胜过F. equiseti；离体叶片试验中F. fujikuroi对高光预处理叶片的致病性更强。重要意义：本研究揭示了光强通过调控宿主生理重塑叶际微环境进而驱动真菌群落定向演替的机制，为植物工厂精准光环境管理、平衡农业产量与微生态健康提供了理论依据。关键技术方法：研究在受控环境植物工厂中进行，以草莓'粉玉'为材料，设置LL（226.4 μmol·m^?2·s^?1）、ML（452.8 μmol·m^?2·s^?1）和HL（600 μmol·m^?2·s^?1）3个光强处理（各16次重复）；测定农艺指标、叶片抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性和H₂O₂含量及果实品质；基于ITS1区域扩增子测序和QIIME2/UNITE分析叶际真菌组群落结构与多样性；开展体外H₂O₂胁迫生长试验和H₂O₂降解能力测定；进行离体叶片致病性试验；采用R软件进行统计分析（PERMANOVA、Tukey's HSD、Pearson相关分析）。样本队列来源：草莓植株（Fragaria × ananassa 'Fen Yu'）栽培于浙江省农业科学院（中国杭州）受控环境植物工厂。研究结果：3.1 植株生长指标与叶片抗氧化酶活性：通过三年生长期记录和红熟期酶活测定，发现ML处理组株高和花数高于HL组，HL组各项参数最低（P < 0.05）；叶柄长度随时间逐渐缩短，HL处理下降最明显（P < 0.05）；第8周时HL组叶宽、叶长和果数达最大值。绿果期ML和HL处理果实总可滴定酸显著高于LL；LL处理果实可溶性糖含量最高，显著高于HL。红熟期总可滴定酸和可溶性糖含量均呈ML > LL > HL的排序，ML处理两指标均高于LL和HL，HL显著最低。随光强增加，SOD活性逐渐下降，HL显著低于LL；POD和CAT活性显著上调，HL显著高于LL。H₂O₂含量在LL下逐渐下降，而HL处理叶片在48和96 h显著高于LL（P < 0.05）。3.2 不同光强下叶际真菌多样性：通过ITS1扩增子测序和PCoA分析，发现光强和生长阶段显著塑造叶际真菌群落；开花期ML以Arthroderma和Derxomyces为主，LL和HL以Pseudozyma和Penicillium为主；结果期ML中Trichosporon富集，LL和HL群落以Penicillium、Davidiella和Botryotinia为主。PCoA显示ML形成与LL和HL紧密聚集不同的独立簇，PCoA1和PCoA2共解释66.87%的总变异。α多样性（Shannon和Simpson指数）在LL和HL下均低于ML。3.3 叶片抗氧化酶与叶际真菌的关系：通过Pearson相关分析，发现一个注释为F. acutatum的ASV（ZOTU-299）与CAT活性显著正相关（P = 0.0038），与SOD活性显著负相关（P = 0.0209）；Cryptococcus carnescens和C. flavescens与SOD活性强正相关（P = 0.0116和P = 0.0069），与CAT和POD弱负相关。除该F. acutatum ASV外，群落中其他Fusarium种与所测酶无显著相关。BLAST搜索显示ZOTU-299对F. acutatum和F. fujikuroi相似性均为93.48%，表明ITS序列不能可靠区分近缘Fusarium种；系统发育分析将ZOTU-299和培养的F. fujikuroi菌株S12置于FFSC内。因此选F. fujikuroi S12作为FFSC代表菌株测试氧化胁迫耐受性，F. equiseti S16（非FFSC成员）作为对照。3.4 Fusarium菌株对过氧化氢胁迫的响应：通过固体平板和液体培养生长试验及残余H₂O₂测定，发现随H₂O₂浓度增加，F. fujikuroi生长基本不受抑制，而F. equiseti在25和50 mM下生长显著受抑；H₂O₂浓度低于10 mM时两菌株生长曲线相当，超过25 mM时F. fujikuroi耐受性更优，48 h后生长速率明显快于F. equiseti；50 mM H₂O₂下F. fujikuroi在72 h后启动生长，F. equiseti整个观察期无生长。25 mM初始浓度下，F. fujikuroi残余H₂O₂比例48 h降至约28%，96 h降至约12%；50 mM下48 h维持约89%，96 h缓慢降至约65%；F. equiseti在25 mM下48 h降至约81%，96 h降至约32%，50 mM下残余比例下降缓慢。离体叶片试验中，F. fujikuroi对HL预处理叶片的褪绿症状较LL更严重，提示HL诱导的叶片生理变化可能使组织更易感Fusarium侵染。讨论部分总结：4.1 光强作为宿主生理和叶际真菌组的双重决定因素：HL处理初期刺激草莓营养生长和果实品质，同时触发强烈氧化胁迫响应，CAT和POD活性显著上调，SOD活性随光强增加显著下降，反映叶片面临严重H₂O₂积累压力，迫使植物上调关键酶以维持细胞氧化还原稳态；HL导致叶片H₂O₂显著积累，呈动态峰值后持续高水平。这种防御响应诱导带来显著碳和能量需求，可能解释HL下果实糖酸比降低。光驱动的生理重塑延伸至叶际真菌群落重塑；相关分析显示注释为F. acutatum的ASV（可能代表FFSC成员）与CAT活性高度显著正相关，提示环境诱导的病原富集可能与HL胁迫下宿主内部生理稳态转变相关；CAT上调与叶片持续H₂O₂相关氧化胁迫一致，可能为叶际真菌提供氧化选择环境。与F. equiseti等胁迫敏感真菌不同，FFSC成员不仅能耐受氧化爆发，还可能利用其占据空出的生态位，支持高光强无意中为高风险病原菌创造有利生态位、对植物生产力和食品安全构成双重威胁的假设。4.2 真菌菌株对氧化胁迫差异响应的机制：叶际真菌群落的定向演替是宿主生理状态与真菌适应性协同互作的结果。Cryptococcus与草莓叶片SOD活性显著正相关，其相对丰度随光强增加和SOD活性下降而降低，与将其鉴定为典型叶际酵母的先前观察一致；Cryptococcus通常缺乏中和高浓度宿主源ROS所需的专门调控网络，在高光诱导的氧化爆发中处于竞争劣势。根据群落动态模型，这种胁迫诱导的优势表生菌下降创造显著生态位真空，为FFSC等耐胁迫微生物群增殖提供机会。FFSC成员表现相反响应模式，提示FFSC不仅具有更优清除系统，还可能采用光感知策略，将辐照度感知为启动抗氧化系统的线索；证据表明F. fujikuroi中White Collar蛋白WcoA作为全局光调控因子，协调光保护基因的转录激活，触发类胡萝卜素生物合成作为内源性淬灭剂，使FFSC成员能预先构建防御屏障抵御后续氧化爆发。因此HL诱导的化学景观作为部分选择性过滤器，有利于这些病原菌而非胁迫敏感共生菌。4.3 FFSC相关氧化胁迫耐受性和致病潜力的功能证据：尽管ITS测序数据指向F. acutatum，但ITS标记在FFSC内存在分类学模糊性；利用分离菌株S12（F. fujikuroi）作为FFSC代表进行功能验证，将氧化胁迫假设锚定在物种复合群水平。采用高达50 mM H₂O₂作为严格实验氧化挑战，该浓度并非重现叶片组织稳态H₂O₂浓度或叶际真菌经历的平均H₂O₂浓度，而是基于植物-病原互作可诱导质外体和细胞壁区域快速高度局部化H₂O₂积累的证据；定量估计表明H₂O₂在 elicited 植物细胞培养中可积累至约毫摩尔浓度，理论计算进一步表明质外体空间局部毫摩尔级H₂O₂可对植物组织经历的氧化负荷产生实质贡献；因此50 mM处理应解释为探测真菌菌株耐受上限的严格氧化胁迫挑战，而非草莓叶际生理H₂O₂浓度的直接估计。结果表明F. fujikuroi和F. equiseti在高浓度H₂O₂耐受性上存在显著差异；两菌株在低H₂O₂浓度下均正常生长，但F. fujikuroi在升高H₂O₂胁迫下表现更优代谢适应，在50 mM下经适应滞后期后恢复生长；该滞后期可能反映激活保守氧化胁迫响应机制所需时间，可能包括血红素过氧化物酶转录上调和DNA修复复合体组装；相比之下F. equiseti虽也显示相当H₂O₂降解能力，但其生长受高H₂O₂浓度显著抑制。这种差异提示FFSC成员可能不仅依赖快速H₂O₂降解，还拥有高度保守且稳健的抗氧化防御系统，能在严重氧化爆发中中和毒性ROS并维持细胞活力。F. verticillioides利用两个关键过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因FvCP01和FvCP02主动解毒外源ROS并维持氧化还原稳态；F. proliferatum作为FFSC另一关键成员，对H₂O₂诱导的氧化胁迫表现高适应能力，不仅维持菌丝生长还激活稳健酶促抗氧化防御系统；这些发现与本文观察到的F. fujikuroi生理特性高度一致，支持稳健氧化胁迫耐受性可能是某些FFSC成员反复出现的性状。离体叶片试验中F. fujikuroi S12对HL预处理叶片引起更严重病害，与高光诱导宿主生理变化可能增加对氧化胁迫耐受型Fusarium感染易感性的可能性一致；这种"先锋适应"策略使病原菌能在宿主防御响应强烈时期完成定殖；因此FFSC富集不仅是环境选择的副产物，也是利用代谢优势扩张生态位的主动致病策略。4.4 叶际真菌群落变化：叶际真菌群落组装是由植物发育阶段和环境过滤器（特别是光强）协同效应驱动的动态过程。PCoA结果证实ML构建的真菌群组成与LL和HL处理明显分离，表明辐照度是演替轨迹的主要决定因素。开花期ML处理群落以非致病类群Arthroderma和Derxomyces为主，这些类群可能作为早期定殖者通过生态位抢占和营养竞争间接阻碍潜在病原菌建立。随着植株进入结果期，ML条件下有益生防酵母Pseudozyma aphidis相对丰度显著增加；作为多产拮抗菌，P. aphidis不仅分泌强效抗真菌代谢物，还引发宿主诱导系统抗性，在果实成熟期抑制灰霉病（Botryotinia fuckeliana）爆发中起关键作用。相反，HL条件下微生态平衡严重破坏，结果期真菌群落发生明显致病性转变，Cladosporium colombiae、Penicillium brevicompactum和B. fuckeliana成为优势类群。这种演替分歧提示高光诱导的宿主生理胁迫作为选择力有利于耐胁迫病原菌（如FFSC），同时引发真菌失调；该过程可能由叶表面化学景观改变介导，如可用糖耗竭或特定氨基酸渗出，削弱Pseudozyma等有益微生物的竞争排斥能力。"益生菌丧失"和"病原菌富集"的耦合效应显著提高果实感染的生态风险。因此，对于室内植物工厂实践，建议在结果期采用动态光照策略，转回ML范围以优化果实产量、代谢品质和整体微生态健康之间的平衡。研究结论翻译：本研究为光强如何通过调控宿主生理和重塑叶际微环境支配真菌群落演替提供了重要见解。研究结果表明，过度光照触发草莓植株强烈氧化胁迫，这与叶片对FFSC成员感染的易感性增加相关。这些结果为优化植物工厂光照策略提供了有价值框架，凸显了动态光照调控在平衡农业产量与微生态健康中的关键作用。虽然离体试验为FFSC相关氧化耐受性提供了概念验证，但此类模型不能完全捕捉系统性植物响应。未来研究必须采用全株感染模型和转录组分析，以阐明植物代谢重塑和"环境-宿主-微生物"三方关系。此外，需要直接分离和表征相应的ITS注释物种，以确定观察到的氧化耐受性是物种特异性还是FFSC内保守性状。总之，本研究为室内栽培草莓光环境精准管理提供了理论依据。