Ophiobolins介导Bipolaris sorghicola通过甲羟戊酸途径实现宿主穿透与致病性

《Plant Physiology and Biochemistry》：Ophiobolins mediate host penetration and virulence in Bipolaris sorghicola via the mevalonate pathway

　　

Ophiobolins（蛇孢菌素类）介导Bipolaris sorghicola通过甲羟戊酸（MVA）途径实现宿主穿透与致病性。Lovastatin处理降低了Bipolaris sorghicola的致病性。MVA途径扰动与ophiobolin产量降低相关。Lovastatin显著降低了宿主穿透和侵入性真菌发育。Ophiobolin A促进了感染相关发育并损伤宿主组织。Ophiobolins与B. sorghicola侵染过程中的宿主穿透相关。

研究背景：高粱（Sorghum bicolor）是全球第五大禾谷类作物，具有耐干旱、耐高温、耐盐碱和耐涝等特性，在非洲、亚洲和美洲广泛种植。由子囊菌Bipolaris sorghicola引起的靶斑病是高粱最具破坏性的叶部病害之一，在高温高湿条件下产量损失可达50%。该病害以沿叶脉排列的矩形病斑为特征，严重感染时病斑可融合。植物病原真菌利用次级代谢产物在致病性和宿主操控中发挥关键作用。Bipolaris属真菌可产生多种生物活性化合物，包括聚酮类和萜类化合物，具有植物毒性、抗菌和细胞毒性活性。Ophiobolins是一类具有独特5-8-5三环环系统的二倍半萜（C25），最初从Ophiobolus miyabeanus（现为B. oryzae）中分离，已在多种Bipolaris物种中被鉴定，具有钙调蛋白抑制、抗癌细胞毒性和抗菌等多种生物活性。然而，其在真菌致病性中的功能作用尚不清楚。Ophiobolin生物合成起源于甲羟戊酸（MVA）途径，该途径产生通用异戊二烯前体异戊烯基二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）。在真菌中，该途径位于细胞质中，始于乙酰辅酶A缩合形成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA），随后由HMG-CoA还原酶（HMGR）还原为甲羟戊酸，HMGR是异戊二烯生物合成中的关键限速酶。下游酶包括IPP异构酶（IPPI）、法尼基二磷酸合酶（FPPS）和香叶基香叶基二磷酸合酶（GGPPS），参与形成异戊二烯中间体，最终生成香叶基法尼基二磷酸（GFPP），即ophiobolins的直接前体。比较基因组学研究已在Bipolaris物种中鉴定出保守的ophiobolin生物合成基因簇（oblA–D），支持该属内ophiobolin产生能力的保守性。然而，将ophiobolin产生与毒力直接联系的功能证据仍然有限。Lovastatin（mevinolin）是一种从Aspergillus terreus中分离的真菌次级代谢产物，其活性β-羟基酸形式可竞争性抑制HMGR。尽管作为降胆固醇药物广泛用于临床，lovastatin也被用作探究多种生物中MVA途径功能的工具。在植物病原真菌中，HMGR抑制已显示可改变萜类代谢和次级代谢产物产生，但响应因物种而异。然而，仅凭药理学抑制无法建立单个MVA途径或ophiobolin生物合成基因对真菌毒力的直接遗传贡献，凸显了补充功能方法的价值。本研究通过使用lovastatin药理学扰动MVA途径，研究了ophiobolins在Bipolaris sorghicola致病性中的作用。研究人员假设HMGR依赖性MVA途径的扰动会降低ophiobolin生物合成并 consequently损害真菌致病性。通过整合致病性测定、基因表达分析、代谢物谱分析、显微镜检查和ophiobolin A回补实验，研究人员检查了MVA途径扰动、ophiobolin产生和真菌致病性之间的关系，特别关注宿主穿透。这些发现为次级代谢在B. sorghicola感染中的作用提供了新见解，并强调MVA途径作为疾病管理背景下进一步研究的潜在靶点。

研究方法：研究人员使用了Bipolaris sorghicola菌株（保存于中国辽宁省农业科学院高粱研究所），在PDA培养基上25 °C培养。采用燕麦琼脂培养基（OMA）在黑暗25 °C培养5天后近紫外光（365 nm）照射72 h诱导产孢。孢子悬浮液调整至1×10⁵ spores/mL。Lovastatin溶解于DMSO制备10 mg/mL母液，稀释至10、100、500、1000和1500 μg/mL的标称浓度。浓度依赖实验中将孢子悬浮液与lovastatin在25 °C黑暗120 rpm振荡孵育24 h；时间进程实验中用1000 μg/mL lovastatin处理2、8、24或48 h后接种。高粱品种辽粘-3在温室条件（25±2 °C，16 h光周期，>90%相对湿度）下生长至四叶期，取第三片完全展开叶进行离体接种，3 dpi评估病斑直径和形态。回补实验中设置4个处理：未处理对照孢子（CK）、lovastatin处理孢子（LOV；1000 μg/mL）、lovastatin处理孢子补充OpA（LOV+OpA；10 μg/mL）和单独OpA（10 μg/mL）无真菌孢子。创伤接种实验中使用无菌400目砂纸轻轻磨损叶面后接种。显微镜观察在接种后24和48 h收集叶片样品，乳酸酚棉蓝染色后用Olympus BX53显微镜100×观察孢子萌发、芽管发育、附着胞形成、宿主穿透和侵入性菌丝发育。穿透效率计算为显示成功穿透的感染位点占检查的萌发分生孢子/附着胞的百分比。生物信息学分析从NCBI数据库检索Bipolaris cookei的HMGR、IPPI、FPPS和GGPPS蛋白序列，通过BLASTP搜索鉴定同源序列，使用ClustalW比对，MEGA11中邻接法（NJ）构建系统发育树（1000次bootstrap重复），iTOL增强进化树展示。使用SMART数据库和NCBI CDD进行保守结构域分析，MEME Suite进行保守基序分析（最大基序数设为10）。RNA提取使用RNA Simple Total RNA Kit（天根），从lovastatin处理后2、8、24、36和48 h收集的菌丝体中提取总RNA，Super M-MLV III RT Kit合成第一链cDNA，ABI 7500 Real-Time PCR System进行qPCR，以actin为内参基因，2^?ΔΔCt法计算相对基因表达。Ophiobolin含量使用LC-MS/MS分析，培养上清液冻干后在70%乙腈中复溶，Thermo Syncronis C18柱分离，AB SCIEX Triple Quad 3500系统正离子ESI模式MRM检测。监测的离子对为：ophiobolin A（OpA），m/z 401.2→365.1和401.2→267.0；ophiobolin B（OpB），m/z 403.2→349.2和403.2→367.2；ophiobolin C（OpC），m/z 387.2→351.2和387.2→369.2。使用authentic standards构建校准曲线（10-1000 ng/mL）。Ophiobolin A对高粱叶片生理影响的分析中，叶圆片在OpA溶液（25、50、100、200 μM）中孵育， conductivity meter测定电解质泄漏，硫代巴比妥酸（TBA）法测定丙二醛（MDA）含量，商业试剂盒测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性。所有实验至少包含三个独立生物学重复，数据以mean±SD表示，使用SPSS Statistics v17.0进行单因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比较检验，P<0.05认为差异显著。

研究结果：

3.1 Lovastatin以浓度和时间依赖方式抑制B. sorghicola的致病性

通过用HMGR抑制剂lovastatin处理孢子悬浮液后评估离体高粱叶片上的病害发展，研究人员观察到病害严重程度的明显剂量依赖性降低。对照叶片（0 μg/mL）沿叶脉发展出广泛的典型矩形坏死病斑。在较低标称浓度（10和100 μg/mL）下，病斑大小适度减小，而在500和1000 μg/mL下症状逐渐减弱。时间进程实验显示短时间处理（2和8 h）影响较小，而24 h处理显著降低病害症状。2和8 h时病斑直径分别为26.3±1.1 mm和22.5±1.9 mm，24 h后降至4.2±0.8 mm（P<0.001），约减少84%。对照叶片病斑持续扩展，48 h达到29.5±1.8 mm，而lovastatin处理样品在24 h后病斑维持在约4 mm。对照叶片平均病斑直径为28.5±2.1 mm，lovastatin处理在10、100、500、1000和1500 μg/mL标称浓度下分别降低病斑发展14.7%、34.4%、56.5%、88.8%和89.5%。1000和1500 μg/mL下相似的效果可能反映生物响应平台期或lovastatin在高标称浓度下的有限溶解度。这些结果表明lovastatin处理与B. sorghicola致病性的浓度和时间依赖性降低相关。

3.2 外源ophiobolin A部分恢复lovastatin处理Bipolaris sorghicola的感染相关表型

通过补充纯化ophiobolin A（OpA）进行回补实验，评估病害发展和真菌定殖。在离体叶片上，lovastatin处理（1000 μg/mL；LOV）孢子仅产生微弱症状，病斑小而分散，而对照（CK）显示严重坏死和典型靶斑病斑。当OpA（10 μg/mL）加入lovastatin处理孢子（LOV+OpA）时，病斑发展显著恢复并接近对照。然而，OpA单独在无真菌孢子时也产生可见坏死斑点，表明直接植物毒性。创伤接种实验显示机械损伤后对照和lovastatin处理接种之间的病斑发展差异显著减小，两种处理均在创伤组织上产生病斑。显微镜观察显示接种后24 h对照样品显示广泛菌丝生长和表皮组织穿透，而lovastatin处理样品菌丝发育显著减少，几乎没有成功侵入的证据。LOV+OpA处理中观察到密集真菌菌丝网络，与LOV处理相比感染相关真菌发育增加一致。48 h时对照样品观察到广泛定殖，lovastatin处理样品继续显示侵入性发育显著减少。重要的是，显微镜检查显示lovastatin处理孢子能够在叶表面萌发并形成芽管和附着胞样结构，尽管随后穿透和侵入性菌丝发育减少。定量分析显示lovastatin处理在24和48 h相对于对照降低总菌丝长度约90–92%（P<0.001），而补充OpA使菌丝长度增加至与对照无显著差异的值。宿主穿透效率显示相似模式：lovastatin处理显著降低穿透，而LOV+OpA处理穿透与对照无显著差异。这些结果表明lovastatin处理与穿透和随后侵入性发育的强烈减少相关，而外源OpA缓解这些感染相关表型，支持MVA途径扰动、ophiobolin产生减少和宿主感染受损之间的关联，在穿透阶段具有显著表型。

3.3 Bipolaris sorghicola在不同植物物种上表现相似的感染相关发育

为更好理解B. sorghicola的感染行为，研究人员检查了四种植物物种表皮细胞中的真菌定殖：大麦和洋葱（单子叶植物）、拟南芥（双子叶植物）和高粱（自然宿主）。在所有物种中观察到感染相关真菌发育的相似进程。在大麦中，B. sorghicola以逐步方式建立感染：8 h时叶表面仅见少数萌发分生孢子和早期附着胞；24 h时表皮细胞内形成侵入性菌丝，但向邻近细胞扩散仍有限；48 h时菌丝生长广泛，充满感染细胞并延伸至相邻细胞。洋葱表皮提供更好光学分辨率：8 h时分生孢子萌发产生伸长芽管和附着胞；24 h时观察到两种不同真菌生长模式——直接穿透表皮细胞和细胞间生长；48 h时广泛定殖，密集菌丝网络跨多个细胞扩散。拟南芥上早期阶段（8 h）真菌生长主要限于表面；24 h时菌丝扩散至整个表皮层包括细胞间区域；48 h时观察到密集色素化菌丝网络。高粱自然宿主上感染相关发育进展更快：8 h时已可见多个穿透事件；24 h时表皮细胞内建立明显的细胞内菌丝和感染结构；48 h时广泛定殖，密集菌丝积累和形态上类似分生孢子梗的结构。总体而言，B. sorghicola在所检查的植物组织中显示 broadly相似的感染相关发育序列，在高粱中观察到更早和更广泛的定殖。

3.4 Ophiobolin A诱导高粱叶片氧化应激并改变抗氧化响应

为检查OpA如何影响宿主植物生理，研究人员分析了用纯化毒素处理的高粱叶片中的膜完整性、脂质过氧化和抗氧化酶活性。MDA含量作为脂质过氧化指标：OpA处理叶片（50 μM）中MDA水平随时间增加，从2 h的10.8 nmol/g上升至10 h的18.9 nmol/g，而对照样品保持相对稳定。SOD活性在对照叶片中随时间逐渐增加，处理样品在早期时间点（2–6 h）SOD活性较低，随后增加并在8 h达到峰值后下降。APX活性在处理叶片中从2 h的3.4 μmol min^?1增加至6 h的4.7 μmol min^?1，随后逐渐下降，而对照保持相对稳定。CAT活性在处理样品中早期时间点增加，4 h达到第一个峰值，随后暂时下降并在10 h第二次增加，显示双相模式。膜完整性通过相对电导率评估：OpA处理导致电解质泄漏的浓度依赖性增加，较低浓度（10–25 μM）引起适度增加，较高浓度（50–100 μM）导致电导率大幅增加，200 μM时电导率在早期时间点迅速上升后趋于稳定。对照样品整个实验期间保持低电导率。这些结果表明OpA影响高粱叶片膜完整性并改变抗氧化响应，与OpA暴露后细胞应激诱导一致。

3.5 萜类途径基因的生物信息学表征

为 further支持关键萜类生物合成基因的身份和进化保守性，研究人员分析了HMGR、IPPI、FPPS和GGPPS的系统发育关系、序列保守性、结构域架构和保守基序组成。系统发育分析将所有序列分为四个明确的分支对应四个酶家族。每个分支内，Bipolaris cookei序列与相关真菌物种特别是其他Bipolaris类群的同源物紧密聚类，表明高水平进化保守性。多序列比对揭示每个基因家族内保守序列区域，这些区域在物种间显示有限变异。结构域分析确认这些蛋白的保守架构：IPPI含有特征性NUDIX结构域，与异戊烯基二磷酸异构化作用一致；FPPS和GGPPS均具有保守的polyprenyl_synt结构域，支持其作为参与法尼基和香叶基香叶基二磷酸生物合成的异戊烯基转移酶的分类；HMGR显示更复杂的组织，包括N端HPIP区域、甾醇感应结构域和C端催化结构域，这种多结构域结构与其作为MVA途径限速酶的调节和催化功能一致。基序分析鉴定出十个保守基序分布在四种蛋白中，HMGR显示最广泛的基序分布，FPPS和GGPPS主要在其中心功能区域含有保守基序，IPPI显示更紧凑的基序组织。系统发育、序列、结构域和基序分析共同支持HMGR、IPPI、FPPS和GGPPS作为B. cookei中萜类生物合成途径保守组分的分类。

3.6 Lovastatin与ophiobolin生物合成基因表达改变和ophiobolin产生减少相关

为更好理解lovastatin处理与B. sorghicola致病性降低的关系，研究人员检查了MVA途径关键基因（HMGR、IPPI、FPPS和GGPPS）的表达并使用LC-MS/MS测量ophiobolin产生。环境条件影响基因表达：高温（32 °C）下IPPI、FPPS和GGPPS表达较对照（25 °C）增加而HMGR表达降低；酸性条件（pH 4.0）强烈诱导HMGR表达；碱性pH（8.5）和持续光照一般抑制所有四个基因表达。时间进程分析显示HMGR表达快速降低，2 h达到最低水平（对照的0.11倍），随后部分恢复；IPPI表达早期强烈降低并随时间逐渐恢复；FPPS显示不同模式，8 h和48 h表达略有增加；GGPPS表达在24 h最强降低并整个实验期间保持低水平。浓度效应显示较低浓度（25–50 μM）下基因表达适度降低，较高浓度（100–200 μM）下HMGR、IPPI和GGPPS强烈下调而FPPS下降较小。代谢物定量显示对照样品中OpA和OpB随时间积累，48 h分别达到约60 μg/mL和7.2 μg/mL。Lovastatin处理降低两种化合物产生但程度不同：OpA在6 h降低约37%，24 h降低56%，48 h部分恢复；OpB在后时间点抑制>99%。对照培养48 h时OpA:OpB比率约为8.3。由于lovastatin处理培养中OpB丰度极低使比率对小变化高度敏感，未使用该比率进行定量解释。OpC在对照或lovastatin处理PDB培养中均未检测到（低于检测限5 ng/mL）。总体而言，lovastatin处理与ophiobolin产生减少相关，对OpB的影响显著大于OpA。

3.7 Ophiobolin依赖性致病性的拟议机制模型

基于实验结果，研究人员提出机制模型总结ophiobolins与B. sorghicola致病性的潜在关系及MVA途径扰动的影响。首先，数据表明ophiobolins与感染早期阶段特别是宿主穿透相关。Lovastatin处理孢子保留萌发和形成早期表面感染结构的能力，但显示强烈减少的穿透和随后侵入性发育。Lovastatin处理样品中真菌进入宿主组织强烈减少导致有限定殖。补充OpA相对于单独lovastatin处理增加感染相关真菌发育。虽然确切分子靶标尚不清楚，分析表明OpA影响宿主细胞完整性并可能与有利于真菌穿透的条件相关。这一解释得到以下观察支持：（i）lovastatin处理孢子显示降低的致病性；（ii）外源OpA部分缓解感染相关表型；（iii）机械创伤减小对照和lovastatin处理接种之间的差异。此外，OpA单独能够诱导宿主组织坏死症状，表明对植物细胞的直接效应。然而，这种直接植物毒性也意味着OpA诱导的组织损伤对回补表型的贡献不能仅基于病斑大小与增强的真菌发育区分。其次，结果显示lovastatin处理与MVA途径基因表达改变、ophiobolin产生减少和致病性降低相关。Lovastatin靶向HMGR；然而由于本研究中未量化活性β-羟基酸部分，实验条件下HMGR抑制程度未直接确定。与MVA途径扰动一致，lovastatin处理与途径基因表达改变和ophiobolins积累降低相关，这些变化伴随强烈减少的宿主穿透和随后侵入性发育。最后，生理数据为ophiobolins在感染中的作用提供额外背景：OpA处理导致高粱叶片膜损伤增加和抗氧化酶活性改变，这些效应与宿主组织应激响应一致并可能 contribute to与真菌定殖相关的条件。

讨论部分总结：本研究提供证据表明ophiobolins contribute to Bipolaris sorghicola的致病性。Lovastatin药理学扰动MVA途径与致病性降低、HMGR和其他萜类生物合成基因表达改变以及ophiobolin产生减少相关。这些发现与最近比较基因组学研究鉴定Bipolaris物种中保守ophiobolin生物合成基因簇（oblA–D）一致。对lovastatin的浓度和时间依赖性响应进一步支持MVA途径扰动与致病性降低之间的关联。结果中一个有趣的方面是lovastatin对OpA和OpB产生的差异效应：OpB被强烈抑制而OpA以降低水平仍可检测。在对照培养中48 h时OpA:OpB比率约为8.3，lovastatin处理培养中OpB降低>99%显著改变两种同系物的相对丰度。由于lovastatin处理后OpB以极低丰度存在，未使用所得OpA:OpB比率进行定量解释。先前在相关物种包括B. maydis和B. oryzae中的研究表明结构相关的ophiobolins可通过下游生物合成修饰产生，因此OpB的不成比例减少不应仅解释为差异途径调节的证据；前体可用性或晚期转化的差异也可能贡献。由于OpA和OpB之间的具体生物合成关系未经过实验检查，其对lovastatin差异响应的机制仍未解决。感染测定进一步提供ophiobolins可能 contribute to疾病发展的阶段见解。Lovastatin处理孢子显示完整宿主组织感染强烈减少，而外源OpA增加病斑发展和感染相关菌丝发育。机械创伤也显著减小对照和lovastatin处理接种之间的差异。显微镜观察显示lovastatin处理孢子保留萌发和形成芽管及附着胞样结构的能力，但随后穿透和侵入性菌丝发育强烈减少。这些观察与宿主穿透阶段的特别显著效应一致。然而由于OpA单独引起可见坏死，LOV+OpA处理中病斑发展增加不能 exclusively归因于增强的真菌定殖。此外萌发、真菌活力和穿透前生长未独立量化，因此不能排除lovastatin对真菌生理的更广泛影响。OpA处理还增加高粱叶片电解质泄漏和脂质过氧化并改变抗氧化酶活性，与细胞应激和膜相关损伤一致。先前研究同样报道OpA破坏膜完整性和细胞过程。这些效应可能 contribute to有利于真菌穿透和定殖的条件。然而实验未鉴定OpA在植物细胞中的特定分子靶标或建立其与穿透关联的生化机制，ophiobolin活性与宿主穿透之间的关系应解释为功能性而非特定分子机制的证据。基因表达分析揭示MVA途径组分间的差异响应，特别是FPPS在某些时间点显示部分恢复，可能反映补偿性调节因为FPPS contribute to异戊二烯代谢的多个分支。然而整体转录响应保持改变并伴随ophiobolin产生和致病性降低。这些发现支持MVA途径扰动、ophiobolin生物合成和真菌感染之间的关系，尽管这些过程之间的调节联系仍有待确定。生物信息学分析为HMGR、IPPI、FPPS和GGPPS作为B. cookei中萜类前体生物合成保守酶的基于序列的注释提供额外支持。它们与相关Bipolaris物种同源物的系统发育聚类以及保守序列区域、结构域和基序支持其归属相应酶家族。由于这些酶在萜类代谢上游发挥作用，其进化保守性与支持下游次级代谢产物生物合成包括ophiobolins的保守能力一致。从应用角度看，MVA途径作为真菌病害控制的潜在靶标提供进一步研究的基础。Lovastatin本身在农业应用中可能有实际限制，但与MVA依赖性ophiobolin生物合成相关的酶和调节组分可为未来研究提供靶标。虽然药理学抑制提供检查MVA途径、ophiobolin生物合成和致病性之间关系的有用方法，但缺乏直接遗传验证仍是本研究的重要限制。靶向破坏或沉默HMGR或ophiobolin生物合成基因将为其在毒力中的作用提供更强因果证据。本研究有几个限制：致病性主要使用离体叶片测定评估，完整植物和田间条件下的验证将很重要；不能排除lovastatin对真菌生理的更广泛影响因为真菌生长和活力未独立评估；由于OpA本身引起组织坏死，LOV+OpA回补表型可能反映增强的真菌发育和直接植物毒性两者；ophiobolin定量也受缺乏内标和常规基质净化限制；最后虽然发现支持ophiobolin产生与宿主穿透之间的关联，但 underlying分子靶标和机制仍有待确定。

研究结论翻译：总之，本研究提供证据表明ophiobolins contribute to Bipolaris sorghicola的致病性。Lovastatin处理与MVA途径基因表达改变、ophiobolin产生减少和致病性降低相关。外源ophiobolin A部分缓解lovastatin处理孢子的感染相关表型，而显微镜观察揭示lovastatin处理后宿主穿透和侵入性发育的显著减少。Ophiobolin A还诱导高粱叶片膜损伤和改变抗氧化响应，支持ophiobolin活性与宿主组织响应之间的功能关系。总体而言，研究发现支持MVA途径扰动、ophiobolin产生和B. sorghicola致病性之间的关联，特别是在宿主穿透期间，而 underlying分子机制仍有待确定。